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氧化修饰高密度脂蛋白诱导NLRP3炎性小体活化促进动脉粥样硬化的机制研究

秦卫伟  
【摘要】:动脉粥样硬化是一种以动脉血管壁脂质沉积为特点的炎症反应性疾病。高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)水平与动脉粥样硬化发病呈负相关,HDL通过胆固醇逆转运、抗凋亡、抗氧化、抗炎等机制发挥抗动脉粥样硬化作用。然而,慢性炎性疾病如2型糖尿病、代谢综合征、慢性肾脏疾病时,HDL生理功能发生改变。失功能HDL表现为HDL颗粒组分构成及HDL的修饰性改变。其中,HDL的氧化修饰是最常见的类型,氧化修饰高密度脂蛋白(ox-HDL)正常的生理功能丧失,具有促氧化、促凋亡及促炎作用。炎性小体是参与固有免疫的细胞内复合物,通过识别损伤信号而活化,进而促进pro-IL-1β、pro-IL-18的切除成熟,还能通过caspase-1途径引起细胞焦亡。目前,有关NLRP3炎性小体的研究最为深入,NLRP3炎性小体被认为是脂质代谢与炎性反应的中间环节。在动脉粥样硬化进展过程中,胆固醇晶体和氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)可激活NLRP3炎性小体,而氧化应激、溶酶体裂解、线粒体功能障碍、内质网应激等途径参与NLRP3炎性小体的活化。同ox-LDL一样,ox-HDL也可被巨噬细胞吞噬形成脂质蓄积,并通过氧化应激诱导巨噬细胞凋亡,还可通过NF-κB途径上调内皮细胞VCAM-1表达,并促进人单核细胞和小鼠巨噬细胞IL-1β、IL-6及TNF-α生成。然而有关ox-HDL与NLRP3炎性小体的研究未见报道。本课题将从人群、细胞、动物三个水平对冠心病患者血清ox-HDL与NLRP3水平的相关性、ox-HDL诱导NLRP3炎性小体活化的分子机制及ox-HDL对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化进展的影响做深入探讨。目的:1.测定不同类型冠心病患者血清ox-HDL、NLRP3、IL-1β、IL-18水平,分析上述指标与冠状动脉病变程度Gensini评分、ox-HDL水平与各炎性指标的相关性,探讨ox-HDL与NLRP3炎性小体的潜在联系。2.体外观察ox-HDL处理对巨噬细胞脂质沉积、ROS水平、细胞焦亡的影响,通过测定NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达、LDH释放率、细胞上清IL-1β、IL-18水平明确ox-HDL是否可激活NLRP3炎性小体,并探讨及潜在机制。3.在体观察ox-HDL对高脂喂养apoE-/-小鼠动脉粥样硬化进展的影响,通过测定斑块内脂质及巨噬细胞含量,斑块内NLRP3炎性小体相关蛋白表达水平、斑块内ROS水平、细胞焦亡及血清IL-1β、IL-18水平,探讨ox-HDL致动脉硬化的潜在机制。方法:1.纳入25例健康志愿者和55例临床患者,据症状、冠脉造影、心电图及心梗标志物结果分为健康对照组(25例)、稳定型冠心病组(28例)、急性心肌梗死组(27例)。收集三组人群血清、一般资料及血清生化指标,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清ox-HDL、NLRP3、IL-1β、IL-18水平,据冠状动脉造影结果计算冠状动脉病变程度Gensini评分。比较各组间上述指标的差异,并对脂质各组分、ox-HDL与NLRP3、IL-1β、IL-18水平行相关性分析。2.体外分离培养小鼠腹腔来源巨噬细胞,采用不同浓度梯度ox-HDL处理巨噬细胞24小时,油红O染色测定巨噬细胞脂质含量,DHE染色测定细胞内ROS水平,AnnexinV-FITC/PI双染标记观察焦亡细胞比例,Western blot测定细胞NLRP3、ASC、caspase-1表达水平,ELISA法测定LDH释放率及细胞上清IL-1β、IL-18含量。3.8周龄apoE-/-小鼠高脂饲养至12周时,尾静脉注射ox-HDL(14mg/kg)或等体积生理盐水,2次/周,共6周,18周龄时处死。主动脉大体油红O染色观察斑块体积,MOVAT染色及天狼星红染色观察斑块形态、纤维帽厚度及胶原含量变化,免疫荧光检测斑块内ROS水平、TUNEL染色观察死亡细胞比例,免疫组化测定斑块内NLRP3、caspase-1蛋白表达水平,ELISA法测定血清IL-1β、IL-18含量。结果:1.与健康对照组相比,稳定型冠心病组与急性急性心肌梗死组ox-HDL水平升高(1052.7±459.1 vs 851.4±408.5pg/ml,p=0.042;1168.4±320.3 vs 851.4±408.5pg/ml,p=0.006),急性心肌梗死组与稳定型冠心病组比较ox-HDL水平无差异(p=0.288)。与健康对照组相比,稳定型冠心病组、急性心肌梗死组NLRP3、IL-1β、IL-18水平升高,组间比较显示两组间差异均具有统计学意义(p0.05)。急性心肌梗死组与稳定冠心病组比较,Gensini评分升高(37.2±27.1vs11.1±9.1,p0.005);Pearson相关系数显示冠心病患者(稳定型冠心病组和急性心肌梗死组)血清NLRP3、IL-1β、IL-18水平与Gensini评分呈正相关,r值分别为0.413,0.289,0.505,p值均0.05。血清ox-HDL水平与NLRP3、IL-1β、IL-18水平呈正相关,r值分别为0.254,0.299,0.237,p值均0.05。2.差速贴壁法获取的小鼠腹腔来源经F4/80标记,巨噬细胞纯度达95%。采用不同浓度ox-HDL处理巨噬细胞24h,结果显示与天然HDL(n-HDL)相比,ox-HDL处理组巨噬细胞内脂质沉积、ROS生成增加,且与ox-HDL浓度梯度呈正相关。经ox-HDL处理后,巨噬细胞NLRP3、ASC、caspase-1表达上调,AnnexinV/PI双阳性细胞比例增加,且LDH释放率、细胞上清IL-1β、IL-18含量增加。3.经尾静脉注射ox-HDL至apoE-/-小鼠体内,结果显示ox-HDL处理组血清IL-1β、IL-18水平增加,主动脉斑块体积增加,斑块内脂质沉积、ROS水平增加,NLRP3、caspase-1表达上调,TUNEL阳性细胞比例增加,且ox-HDL组纤维帽变薄,平滑肌与胶原含量减少。结论:1.与健康人群比较,冠心病患者血清ox-HDL、NLRP3、IL-1β、IL-18水平升高;血清NLRP3、IL-1β、IL-18水平与冠状动脉病变程度Gensini评分呈正相关;血清ox-HDL水平与NLRP3、IL-1β、IL-18水平呈正相关。2.ox-HDL胆固醇逆转运功能下降,并可被巨噬细胞吞噬引起脂质沉积增加,ox-HDL通过ROS途径诱导NLRP3炎性小体活化,并通过caspase-1途径诱导巨噬细胞焦亡。3.ox-HDL引起apoE-/-小鼠斑块内脂质沉积增加,斑块体积增大;ox-HDL引起apoE-/-小鼠斑块内ROS生成增加,并通过诱导NLRP3炎性小体活化加剧斑块炎性反应;ox-HDL通过诱导斑块内巨噬细胞caspase-1依赖性细胞焦亡加速斑块进展。


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