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脐带间充质干细胞及其外泌因子干预白消安致雄性小鼠生殖损伤的实验研究

黄磊  
【摘要】:目的:探讨人脐带间充质干细胞及其人脐带间充质干细胞分泌因子注射对白消安导致的无精子症模型小鼠的治疗作用。方法:1.人脐带间充质干细胞(HUMSCs)的分离主要采用组织贴壁法获得,将分离的人脐带间充质干细胞进行成骨、成脂诱导分化和细胞表面标记物的鉴定;2.收集第四代HUMSCs体外培养无血清培养基的上清液,经过0.22μm滤器超滤得到浓缩HUMSCs分泌因子(条件培养基,CM)记为HUMSCs-CM;3.将40 mg/kg剂量白消安注射入雄性BALB/C小鼠腹腔中,对照组为生理盐水组。在注射白消安的第4周末,通过苏木素-伊红(HE)染色,观察生精小管的结构;通过荧光定量PCR检测减数分裂基因STRA8、TNP2、SCP3、DDX4、OCT4 mRNA相对表达量;通过蛋白质印迹实验(western-blot)检测睾丸生殖细胞之间黏附蛋白P-钙黏蛋白(P-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、细胞间黏附分子(ICAM-1)的表达;4.将40 mg/kg剂量白消安注射入雄性BALB/C小鼠腹腔中的4周末,随机分为4组:生理盐水组、白消安(busulfan)组、HUMSCs组、HUMSCs-CM组。HUMSCs组和HUMSCs-CM组通过尾静脉分别注射HUMSCs悬液200μl(1×10~7细胞)和HUMSCs-CM 200μl,按照每3天注射1次的频率进行尾静脉注射,连续注射4周。第8周末,通过睾丸组织苏木素-伊红(HE)染色,观察生精小管的结构;通过实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)来检测STRA8、TNP2、SCP3减数分裂基因mRNA相对表达量;通过蛋白质印迹实验(western-blot)检测睾丸细胞黏附蛋白P-钙黏蛋白(P-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、细胞间黏附分子(ICAM-1)的表达。结果:1.原代的HUMSCs使用组织贴壁法分离培养获得,将原代的HUMSCs利用胰酶消化法传代至第4代。镜下观察细胞排列紧密,细胞形态多样,以梭形、椭圆形为主。HUMSCs表面标记物CD90、CD44、CD45、CD29的阳性率分别为99.66%、97.40%、0.10%、94.47%。通过茜素红和油红O对成骨、成脂诱导的细胞进行染色,HUMSCs可以成功分化为钙盐颗粒和脂肪细胞;2.对HUMSCs进行体外无血清F12/DMEM培养基的培养,并收集了上清培养液HUMSCs-CM,测定蛋白浓度为0.60 mg/ml;3.将40 mg/kg剂量白消安注射到小鼠腹腔内,第4周末通过HE染色观察小鼠睾丸生精小管结构,小鼠生精小管中各级生精细胞减少严重,精子活动度减低。基底膜与生精细胞出现断层、分离,生精小管中精原细胞和支持细胞减少严重,精原细胞和精母细胞呈现空泡化;4.第4周末,白消安组(busulfan组)与对照组比较,睾丸中生精细胞减数分裂基因STRA8、TNP2、SCP3、DDX4、OCT4基因表达明显降低(P均0.01);白消安组的细胞黏附相关蛋白N-cadherin、P-cadherin、ICAM-1表达量明显低于对照组蛋白表达量(P均0.01);5.第8周末,通过睾丸组织HE染色,HUMSCs-CM组与白消安组和HUMSCs组比较,基底膜与生精细胞分离和细胞空泡化情况有所改善,生精小管中各级生殖细胞大量存在;6.与白消安组比较,HUMSCs-CM组生精细胞减数分裂基因STRA8、TNP2、SCP3的表达水平均有增加(P均0.01),而HUMSCs组减数分裂基因的表达水平没有明显增加;与HUMSCs组相比,HUMSCs-CM组生精细胞减数分裂基因STRA8、TNP2、SCP3的表达水平均有增加(P均0.05);7.HUMSCs-CM组与白消安组相比,小鼠睾丸生殖细胞之间的黏附相关蛋白N-cadherin、P-cadherin、ICAM-1表达水平均有增加(P均0.01)。而HUMSCs组与白消安组相比,细胞黏附相关蛋白N-cadherin、P-cadherin表达水平没有显著的增加,但是HUMSCs组与白消安组相比,ICAM-1蛋白表达量有增加(P0.05)。结论:1.使用组织贴壁法和胰酶消化法可以成功分离HUMSCs;2.HUMSCs使用无血清F12/DMEM培养基培养,收集上清液并用0.22μm的滤器超滤得到浓缩HUMSCs分泌因子;3.腹腔注射白消安抑制了减数分裂基因STRA8、TNP2、SCP3、DDX4、OCT4的表达和细胞粘附相关蛋白N-cadherin、P-cadherin、ICAM-1的表达,导致了小鼠生精损伤;4.HUMSCs分泌因子保护了白消安导致的生精损伤小鼠,促进了生精细胞减数分裂基因STRA8、TNP2、SCP3和细胞粘附相关蛋白N-cadherin、P-cadherin、ICAM-1的表达。


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