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沼泽红假单胞菌益生特性及对健康小鼠肠道微生物影响的研究

刘海萍  
【摘要】:目的:通过纯化、鉴定、菌株生物量的测定,对沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)的基本特征进行系统验证;通过抑菌实验、人工模拟肠胃液耐受性以及对细胞黏附性实验衡量沼泽红假单胞菌是否具有益生菌特性;通过对小鼠健康指标、血清中胃肠调节肽的检测以及肠道形态的分析、粪便中肠道微生物的高通量测序,探索其如何发挥益生菌的作用。为实现沼泽红假单胞菌作为益生菌应用于临床奠定基础。方法:实验一通过将菌株进行革兰氏染色、PCR扩增基因序列测序、全波长扫描、生长曲线测定、分光光度法与平板计数法结果对应关系的测定,对沼泽红假单胞菌的基本特征进行系统验证。实验二通过采用滤纸片法测定抑菌圈的直径,酶标仪测定法确定菌株的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimum Bactericidal Concentration,MBC),完成沼泽红假单胞菌的抑菌作用实验;通过体外模拟肠胃液耐受性以及对人结直肠腺癌细胞(Caco-2)细胞黏附性实验确定菌株是否具有益生特性。实验三通过对小鼠每2 d体重、饮食量、饮水量的检测实时监测小鼠健康状况;通过对血清中胃肠调节肽胃泌素(Gastrin,Gas)和生长抑素(Somatostatin,SS)的检测,对小鼠结肠、回肠肠道形态的检测以及回肠肠绒毛高度的测量,考察沼泽红假单胞菌对健康小鼠胃肠相关指标的影响;通过对小鼠粪便高通量测序,探究其对健康小鼠肠道微生物的影响。结果:实验一将测序序列进行聚类分析,结果显示该菌株和Rhodopseudomonas palustris(序列号:AF184625.1)亲缘性最近。测定生长曲线中,沼泽红假单胞菌24h进入对数生长期,72 h进入稳定期。沼泽红假单胞菌菌液浓度(y)与吸光度值(x)的线性关系为:y(10~8CFU/mL)=29.123x-1.2844(R~2=0.9999)。实验二该菌株在人工模拟胃液(p H3.0)可耐受3 h且存活率大于50%;在人工模拟肠液(p H8.0)中能够耐受8 h,存活率达到70%以上。当样品浓度为5×10~9CFU/mL时,对大肠杆菌的抑菌圈达到10.40 mm,MIC值为1.25×10~9CFU/mL,MBC值为2.5×10~9CFU/mL;对枯草芽孢杆菌的抑菌圈达到14.70 mm,MIC值为1.25×10~9CFU/mL,MBC值为2.5×10~9 CFU/mL。对Caco-2粘附率为160±16个/cell。实验三通过对小鼠健康指标的监测,结果表明4周内对照组、低剂量组以及中剂量组小鼠体重趋势高度相似,高剂量组从14 d开始体重低于其他三组,并从26 d显著低于对照组体重;同时比较4周内体重增长量,中剂量组和低剂量组较对照组较大,高剂量组增长值较小;高剂量组从14d开始摄食量较其他三组降低;4组小鼠饮水量基本一致。低剂量组对促进Gas分泌的作用较显著(P0.01),中剂量组及高剂量组促进作用无显著性;高剂量组对抑制SS的分泌的作用较显著(P0.05),低剂量组及中剂量组对其分泌也有抑制作用,但没有显著性;菌株4周干预后,回肠肠绒毛高度无显著差异。在菌株干预4周后,在门水平上,实验组拟杆菌门相对丰度显著降低,厚壁菌门和蓝藻菌门丰度显著增加。在科水平上,鼠杆菌科的相对丰度显著降低;毛螺旋菌科、普雷沃氏菌科、理研菌科、乳杆菌科、拟杆菌科、瘤胃菌科相对丰度显著增加。在属水平上,Lachnospiraceae NK4A136 group、乳杆菌属、拟杆菌属、理研菌属和Prevotellaceae UCG-001相对丰度显著增加。结论:沼泽红假单胞菌对数生长期为24-72 h;测定菌液浓度时,分光光度法与平板计数法有着明显的线性关系;其抑菌能力强、能够耐酸耐胆盐,并具有很强的细胞黏附能力,具有益生特性;可维持胃肠激素稳态和肠道形态结构;改善健康小鼠的肠道微生物菌群组成结构,一定程度上增加了肠道内有益菌的相对丰度,发挥了益生作用。


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