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中性粒细胞对培养乳鼠心肌细胞的致凋亡作用与机制分析

顿颖  
【摘要】:近年来,随着分子心血管病学研究的进展,发现在心血管系统的许多生理和病理变化中存在有细胞凋亡现象。1994年,Gotllieb等在对家兔的研究中证实缺血/再灌注可引发心肌细胞凋亡;1997年,Saraste等发现人的心肌缺血/再灌注损伤中也存在有凋亡现象。目前认为细胞凋亡是导致心肌缺血/再灌注损伤的重要因素,但关于心肌缺血/再灌注时引起细胞发生凋亡的机制尚不清楚。过去的大量研究表明,白细胞尤其是中性粒细胞(PMN)与心肌缺血/再灌注损伤有密切关系,并认为其作用机制可能是由于在病理状态下,PMN高表达粘性糖蛋白而大量粘附聚集在缺血/再灌注区,通过释放各种细胞因子和氧自由基等炎症介质引起组织损伤。鉴于PMN在缺血/再灌注损伤中的重要作用,人们开始关注PMN与心肌细胞凋亡的关系。晚近赵志青等的研究发现,PMN在缺血/再灌注区的聚集量与心肌细胞凋亡的数量成正比,提示PMN参与了细胞凋亡的过程;我室先前的工作也显示PMN在缺血/再灌注引起的心肌细胞凋亡中具有重要的作用。然而到目前为止,关于PMN诱发心肌细胞凋亡的作用尚缺乏可信的直接证据。因此,本项研究旨在采用离体的实验体系,以排除体内复杂因素的干扰,从而探讨PMN与心肌细胞凋亡的直接关系,并在此基础上,进而分析PMN引发心肌细胞凋亡的作用机制。此项研究对进一步阐释缺血/再灌注损伤的机理将具有重要意义。本工作由以下四部分组成: 山冠穿医牙斗口冤学博创匕学位论文2003 一、活化的中性粒细胞对培养乳鼠心肌细胞的致凋亡作用 目的:在体实验的研究结果提示,中性粒细胞可能通过释放氧自由 基等物质参与缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡,但由于在体研究的局 限性,尚无直接的证据证明中性粒细胞能直接诱发心肌细胞的凋亡。本 项研究的目的是采用离体的实验体系,观察中性粒细胞是否可直接诱导 心肌细胞的凋亡。 方法:取新生大鼠(1一3天)的心室肌,进行心肌细胞培养,通过 差时贴壁法及阿糖胞昔(10 p mol/L)处理,得到较纯的心室肌细胞, 在1%胎牛血清的DMEM培养液中培养24小时后,开始进行实验。该部 分设五个实验组,即正常对照组,PAF对照组,三个不同剂量的经PAF 活化的PMN处理组(1 05,3火1 05和1 06的P刚分别与3x 106的心肌细 胞,共同孵育48小时),用TUNEL标记,流式细胞分类检测,DNA电泳 分析,透射电镜观察等方法,对心肌细胞凋亡进行检测。 结果:(1)新生乳鼠的心室肌细胞与经PAF活化的大鼠中性粒细胞 共同孵育48小时后,其TUNEL阳性标记的细胞核的百分比显著增加, 而且具有剂量依赖性,三个不同剂量PMN处理组的凋亡细胞百分比分 别为24.95士4.65%,39.92士9.43%,69.02士12.55%,均显著高于正常 对照组(2.81士0.94%,p(0.01)及PAF对照组(2.80士0.77%,p(0.01)。 (见Page 27,Tablel;Page 29,Fig.3.;Page 33,Fig.8.)。(2) 流式细胞分类检测得到相似的实验结果,正常对照组及PAF对照组的凋 亡细胞百分比分别为2.49士0.50%和2.57士0.56%,而经PMN处理后, 三个剂量的PMN组的凋亡细胞百分比分别为22.18士4.70%,36.99士 9 .02%和66.34士1 1.43%(p(0.01)(见Page 27,Tablel;Page 31,Fig.6.;Page 33,Fig.8)。(3)DNA电泳的实验结果显示,PMN处 山冠厅医牙斗大学博d亡学位论文2003 理后的心肌细胞可产生明显的DNA梯带,而正常对照组,PAF对照组及 培养72小时的心肌细胞则无DNA凋亡梯带的出现(见Page30,Fig.4, Fsg.5.)。(4)透射电镜的观察结果显示,lo6PMN与3xzo6的心肌细胞 共同孵一育48小时后,心肌细胞出现凋亡的特征性改变,如细胞核染色 质聚集成致密的团块,并沿核膜处凝聚,细胞核出现固缩,细胞核膜凹 陷,核裂解成碎块,并有凋亡小体出现。另外,线粒体也有不同程度的 损伤(见Page 32,Fig.7.)。 结论:PMN经PAF活化后,可诱导培养乳鼠的心肌细胞发生凋亡。 值得注意的是,我们在实验中发现,当PMN未被PAF活化时,并不引起 上述的改变。 二、PMN诱导培养乳鼠心肌细胞发生凋亡的可能机制 目的:在上述实验的基础上,我们进一步探讨了PMN诱导心肌细胞 凋亡的可能机制。我们首先从PMN在病理条件下,造成组织损伤的基本 环节入手,检测了一些炎性因子,氧化应激反应,iNOS蛋白的表达及 NO浓度的改变,并测定了细胞内重要的信号物质Caz+浓度的变化,同时 我们还检测了PMN对细胞内两个重要的凋亡调节蛋白Bcl一2,Bax表达的 影响,借以揭示PMN引发心肌细胞凋亡的可能原因及作用环节。 方法:实验的分组及操作同前,实验结束时,收集培养液,采用放 射性免疫测定法检测培养液中儿一6,工L一8及TNF。的浓度,黄嗓吟一黄 嗓吟氧化酶法测定Cu一Zn SOD活性,硫巴比妥酸法测定MAD的水平,并 应用硝酸盐还原酶法测定培养液中NO的浓度;同时收集心肌细胞,采 用western blot分析法观察了iNOS,Bel一2和Bax蛋白表达的变化,另 外,还采用荧光影象技术检测了心肌细胞中Caz+浓度的改变。 结果:(l)培养的乳鼠心肌细胞与活化的中性粒细胞共同孵育48 山卫穿医科大学 仁攀d亡学位喇仑文2003 小时后,培养液中的工L一6水平显著增高


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