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性激素对兔血管平滑肌细胞AT_1受体基因表达的作用及机制分析

尚美生  
【摘要】:目的 大量临床和流行病学资料表明,心血管疾病存在明显的性别差异,形成差异的一个重要原因是生育期的女性与同年龄的男性比其心血管发病率较低,而绝经后的女性,则失去了保护心血管的作用,表现为心血管发病率的迅速增加,70岁以上的男、女心血管发病率基本上为1﹕1,动物实验或人体因疾病而切除双侧卵巢后,动脉粥样硬化(AS)的发病率增加,17β-雌二醇(17β-E2)对实验动物AS的二级预防有效,几组大规模回顾性的流行病学研究也表明,激素替代治疗(Hormone replacement therapy HRT)可以降低心血管的发病率和致残率。雌激素保护心血管的假设已很熟悉,几乎成为公理,但雌激素对心血管系统的生理作用并未完全理解。雌激素能降低血浆LDL-C 升高HDL特别是HDL2 ,调节血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscular Cells VSMC s)和内皮细胞的功能,调节血压和血管的生长,雌激素能抗炎、抗凝和抑制纤维蛋白原的形成,影响肾素-血管紧张素系统,雌激素有抗氧化功能,减少自由基的产生,也可当作钙离子拮抗剂,雌激素能与胞浆式受体结合而产生基因效应,也能与雌激素膜受体(mER)结合而产生快速的非基因功能。 然而,心脏雌/孕激素替代治疗研究(HERS)和雌激素替代与动脉粥样硬化研究(ERA)在起始的3-4年中,不论对疾病的进展或者心血管的死亡率并无影响,这个令人意外的结果对传统的HRT提出了挑战,一些研究人员认为,出现这样的原因是由于在HRT方案中合并应用了孕激素(Progesterone, P),孕激素是一种相对“有毒”的化合物,在体内外它能抑制雌激素有益的血管效应,它能导致HDL下降,使雌激素受体下调,减低炭水化合物的耐受性,降低血流等。但有关孕激素治疗能抵消雌激素替代治疗作用的分子机制仍不清楚,是个有争论的问题,某些研究并不支持孕激素有坏的影响。 AT1受体能调节肾素—血管紧张素系统的许多生物效应,诸如血管收缩、 WP=7 水钠潴留,自由基释放和细胞生长,因此AT1受体的活性在心血管疾病的病理中有重要意义,本文假设雌激素与孕激素对心血管系统的抵消效应发生在AT1受体的调节水平上,为了进一步调查这些生殖激素对血管细胞的直接效应,本文检查了它们对血管平滑肌细胞AT1RmRNA表达的影响,并寻求探索其潜在的分子机制。 方法和结果 1. 17β-E2和孕酮影响VSMCs AT1RmRNA表达与时间的关系。实验分五组,分别用0.1nM的17β-E2和0.1nM的孕酮对细胞进行分段处理,具体时间为:0(对照组)、2、4、12、24h,在孵育到相应的时间后,用PBS冲洗细胞两次,然后用胰蛋白酶-EDTA消化,离心收集,提取总RNA,用RT-PCR对AT1RmRNA进行半定量分析。 结果表明,对VSMC s AT1R的影响呈现明显的时间依赖性,17β-E2对VSMCsAT1R的影响2h后开始下降为51±13 % (与对照组比较P0.05),4h时达到最大值为175±8%(与对照组比较P0.01),表现为下调,而孕酮对VSMCs AT1R的影响4h开始上升为24±7 %(与对照组比较P0.05),12h达到最大值为156±18%(与对照组比较P0.01),表现为上调,24h开始下降。 2. 17β-E2和孕酮影响VSMCs AT1RmRNA的浓度依赖性。 为了探索17β-E2和孕酮浓度与VSMCs AT1RmRNA之间的关系,我们将培养的雌性家兔的VSMCs进行了分组:⑴ 对照组, ⑵ 10-12M的17β-E2孵育VSMCs 4h和 10-12 M的孕酮孵育VSMCs 12h ,⑶ 10-10 M 的17β-E2孵育VSMCs 4h和 10-10 M的孕酮孵育VSMCs 12h ,⑷ 10-8 M的17β-E2孵育VSMCs 4h和 10-8 M的孕酮孵育VSMCs 12h, ⑸ 10-6 M的17β-E2孵育VSMCs 4h和10-6 M的孕酮孵育VSMCs 12h 。收集细胞,提取总RNA, 用RT-PCR来测定AT1RmRNA。 结果表明,17β-E2和孕酮对VSMCsAT1RmRNA表达的影响呈现浓度依赖性,当17β-E2浓度是10-10 M(0.1nM)时,对AT1RmRNA的下调影响最大为 112.3±3.3 %(与对照组比较P0.01),而孕酮的浓度是10-10 M(0.1nM)时对AT1RmRNA的上调影响达到最大值为59.9±4.2%(与对照组比较P0.02),不论是雌激素或者是孕激素,当浓度大于或者小于10-10 M, 其下调或上调 AT1RmRNA的作用均非最大。 WP=8 3.17β-E2和孕酮对VSMCs AT1RmRNA蛋白表达的影响。 为了进一步证实17β-E2和孕酮对VSMCsAT1RmRNA蛋白表达的影响,利用Western-blot对其相应的蛋白进行了测定,培养的血管平滑肌细胞分为5组:⑴ 对照组;⑵ 0.1nM的17β-E2与VSMCs共同孵育4h和12h;⑶ 0.1nM的孕酮与VSMCs共同孵育12h和24h。收集细胞,检测蛋白,进行Western-blot测定。结果表明,17β-E2对VSMCs AT1RmRNA蛋白的下调以4h为最大,达到最大值为11.6±1.076 %(与对照组比较P0.05),而孕酮对VSMCs AT1RmRNA蛋白的影响为上调,12h时达到最大值为8.44±1.083 %(与对照组比较P0.05)。 4. 17β-E2和孕酮影响VSMCs AT1RmRNA表达的作用机制分析。 分别用17β-E2和孕酮的特异性受体拮抗剂他莫西芬和米非司酮与VSMCs单独或合并孵育,来证明其作用特异性,并探索其作用机制。细胞分为下面几组:⑴ 对照组;⑵ 0.1nM的17β-E2孵育细胞4h;⑶ 0.1nM的他莫西芬孵育细胞4h;⑷ 0.1nM的17β-E2和0.1nM的他莫西芬联合孵育细


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