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大鼠胰岛β细胞钙离子缓冲力及其对分泌的影响

章毅  
【摘要】:前 言 从神经细胞的突触传递到肌肉细胞兴奋-收缩耦联,钙离子参与了细胞内众多的信号转导过程,其功能的发挥依赖于细胞内钙离子的精确调控。胞内游离钙([Ca2+]i)的调控是一个复杂的过程,某些生物反应可以触发钙离子由细胞膜钙通道流入或从胞内钙库(calcium store)释放进入胞浆,导致胞内钙升高。进入细胞内的钙离子只有极少数表现为游离钙形式,其余大部分钙离子迅速与胞内钙离子缓冲系统(calcium buffers,即胞内可迅速与钙离子结合的物质)结合,随后在相对较长时间内被胞内钙库回收或由钙泵等转运机制排出胞外,使钙离子回到其静息水平,完成其主要生理功能而不致损伤细胞。钙离子缓冲系统在决定胞内游离钙浓度变化及其在细胞内传播的时空特征方面发挥着非常重要的作用。胞内钙缓冲系统由可移动钙缓冲系统(mobile calcium buffers)和不可移动钙缓冲系统(immobile calcium buffers)两部分组成。不可移动钙缓冲系统由非游离的钙结合分子(例如细胞膜上的钙离子结合蛋白)组成,只能调控该钙结合蛋白局部微小区域的钙离子分布;可移动钙缓冲系统由游离的钙结合分子(例如calretinin等)组成,可以在整个胞浆范围内影响游离钙功能的发挥。 胰岛β细胞是胰岛中最主要的细胞,约占胰岛细胞总数的70%以上,其主要生理功能是分泌胰岛素。生理情况下,血糖升高,可使β细胞膜去极化,膜上钙通道开放,钙离子内流,细胞内游离钙浓度升高,最终导致胰岛素分泌;因此胰岛β细胞游离钙水平是调控细胞刺激-分泌耦联过程的关键环节。胰岛素是体内使血糖降低的重要激素,胰岛素分泌功能异常或缺失,是导致糖尿病形成的主要因素之一。因此研究β细胞内游离钙的调控机制,对于更好的理解胰岛素分泌过程有着非常重要的生理意义和临床意义。深入了解胰岛β细胞钙离子缓冲力,探讨其对β细胞游离钙的调控及对胰岛素分泌的影响,是本研究的主要目的。 WP=6 第一部分 大鼠胰岛β细胞钙离子缓冲力测定 钙离子缓冲系统(calcium buffers)在这里是特指能与胞内钙离子快速结合的一类物质,不包括钙库回收和钙泵外排等转运机制。钙离子缓冲力(简称钙缓冲力)是指钙缓冲系统与钙离子的结合能力。细胞内源性钙缓冲力可以被量化为钙结合比值((S),即胞内钙缓冲系统结合的钙离子数目与呈游离状态钙离子数目之比。应用全细胞膜片钳记录方法,将钙敏感的荧光染料(外源性钙缓冲物质)通过电极导入细胞,如果该染料与钙离子的结合特性已知,当一定数量的钙离子进入细胞后,外源性和内源性钙缓冲物质将会与进入细胞的钙离子竞争结合,此时通过计算就可以得出生理情况下细胞内源性钙缓冲力((S)的大小。 方法: 分离150-200g雄性Wistar大鼠胰岛β细胞,挑取培养7天以内,直径11um以上细胞用于实验。采用全细胞膜片钳记录,通过电极内液将0.1-1mM的钙荧光指示剂fura-2K+导入细胞内。在fura-2K+导入及其后与细胞内液平衡过程中,应用电压钳技术多次去极化(刺激时间:50-500ms)触发细胞外钙内流,记录钙电流大小,同时应用显微荧光测钙技术,监测细胞内钙离子与染料的结合及细胞内游离钙浓度的变化,根据外源性和内源性钙缓冲物质与钙离子竞争结合的特点,采用以下公式即可计算出β细胞钙缓冲力((S)。 (1) △[Ca2+]t = △[Ca2+]i + △[BCa]+ △[SCa] 式中△代表浓度变化,[Ca2+]t 是细胞内总的钙浓度,[Ca2+]i 是细胞内游离钙浓度,[BCa]是与fura-2结合的钙浓度,[SCa]是与内源性钙缓冲物质结合的钙浓度。参照Zhou的方法(Zhou Neher, J Physiol, 469:245, 1993)经公式(2)和(3)就可以计算出细胞的钙缓冲力(S。 WP=7 (2) f = △Fd /∫Icadt (3) (S = (B (fmax/f-1)-1 式中Fd是钙敏感的fura-2荧光变化,∫Icadt指进入细胞的钙电流总量。f指钙内流时引发的荧光变化(△Fd,F)与所进入钙电量(∫Icadt ,Q)的比值,即“F/Q”比值,fmax是f达到饱和时的值,(B是指fura-2的钙缓冲力。 2. 结果: fura-2 K+导入β细胞,一般需300~400s达到平衡。 当β细胞内fura-2 K+为主要钙缓冲成份时,每皮库仑钙电量引起的平均最大荧光强度变化为0.0153(0.0008 BU,即平均fmax为0.0153BU。 β细胞(S呈逐渐减小最后稳定于某一水平的单指数变化形式。 β细胞不可移动钙缓冲力平均为79(12,可移动钙缓冲力在1375以上,表明可移动钙缓冲系统为β细胞钙缓冲系统的主要组成部分。 β细胞总的钙缓冲力(S在1454以上,即胞内每增加一个游离钙离子,会有1454个以上的钙离子与胞内钙缓冲物质结合,即约0.7‰进入细胞内的钙离子表现为游离钙形式。 第二部分 大鼠胰岛β细胞钙缓冲力对胰岛素分泌的影响 钙缓冲系统可以影响细胞内钙浓度及钙离子扩散的动力学过程,从而影响细胞生理功能的发挥。不同细胞钙缓冲力不同,甚至不同发育阶段的细胞,钙缓冲力也不一致。β细胞分泌胰岛素是一个依赖于钙离子的刺激-分泌耦联过程,钙缓冲系统在这一过程中有何作用?已知细胞分泌时分 WP=8 泌囊泡与细胞质膜融合过程中质膜表面积会增加,因膜表面积与膜电容成正比,故膜电容的变化可间接反映出分泌量的大小。由膜


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