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人神经元特异性烯醇化酶的基因克隆及单克隆抗体的制备和鉴定

朱爱萍  
【摘要】:神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase ,NSE)是烯醇化酶的一种同工酶。γγ、αγ组成的同工酶为神经元和神经内分泌细胞特有,故命名为神经元特异性烯醇化酶。NSE基因核苷酸序列全长2423bp,开放读码框架从第226到1531个碱基,长度为1305bp,编码全部434个氨基酸。 目的 本研究的目的是通过克隆序列正确的人神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 基因,表达蛋白,制备出鼠抗人神经元特异性烯醇化酶 (NSE)的单克隆抗体,以便为检测肿瘤细胞或组织中NSE抗原提供一种有效的工具。方法 首先利用NSE特异引物,通过RT-PCR从人肺癌细胞株A549中扩增人NSE分子的cDNA全长。与pGEM-T载体连接转化大肠杆菌JM109,构建重组质粒pGEM-T-NSE。重组质粒测序鉴定基因序列,然后将NSE基因定向克隆于原核高效表达载体pMS-31b,转化大肠杆菌POP2136经42℃热诱导获得MS2-NSE融合蛋白。融合蛋白经SDS-PAGE电泳分离、电洗脱 、PBS透析纯化后,免疫BALB/C小鼠。应用常规杂交瘤技术,通过ELISA双筛,筛出能分泌抗人NSE单克隆抗体(NSE McAb)的杂交瘤细胞株并进行体内培养制备腹水。检测其分泌抗体的亚型,据亚型选择不同的纯化方法纯化。然后用细胞化学、特异性、Western-blot等方法鉴定制备抗体的免疫反应及特异性。以自制的NSE McAb采用IHC技术检测NSE在人肺癌细胞A549、BE1(高转移)、LH7(低转移)以及肝癌细胞7402中的表达。结果 本研究克隆了人神经元特异性烯醇化酶基因,测序结果证明克隆的NSE基因序列完全正确,获得了2株能稳定分泌抗NSE单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备了抗NSE的单克隆抗体,经检测其分泌抗体的亚型分别为IgG1和IgG2a。细胞化学结果表明NSE在肺癌细胞A549、BE1(高转移)、LH7(低转移)以及肝癌细胞7402中均表达于胞浆。结论 本研究制备了抗NSE单克隆抗体,初步检测了NSE在肿瘤细胞中的表达情况,为以后进一步研究NSE的功能奠定了基础。


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