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SARS冠状病毒核蛋白的原核表达及初步应用的研究

张强  
【摘要】:严重急性呼吸道综合症(SARS),亦称传染性非典型肺炎。是于 2002 年 1 月中旬在我国华南地区首先出现的一种新型的呼吸系统综合症。随后, SARS 在中国内地和香港、加拿大、新加坡、越南等地呈现暴发行流行的趋 势。SARS 的病源已被确认为一种新型冠状病毒(或冠状病毒变异株),即 SARS 冠状病毒(SRAS-CoV),在短短一个月间,十余株不同 SRAS-CoV 的全基因序列已登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)的 GeneBank 。 在已知类似冠状病毒开放阅读框分析的基础上,对 SARS-CoV 初步的基因 组注释已经完成,根据其基因编码,预测得到的主要蛋白质有 RNA聚合酶 蛋白、刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、核衣壳蛋白(简称核蛋白,N)、膜 蛋白(M)等。以往对动物冠状病毒结构蛋白的研究发现,冠状病毒的 N 蛋白在病毒复制和产生的病理反应中起重要作用。本研究拟用重组 SARS 冠状病毒 N 蛋白建立间接 ELISA,检测 SARS 患者血清标本中抗 SARS 冠 状病毒 N 蛋白的抗体 IgM、IgG。了解 SARS 冠状病毒 N 蛋白在人体内的 免疫原性。旨在阐明 SARS 冠状病毒感染机体免疫应答的机制,为研究 SARS 冠状病毒感染的机制和有效的诊断试剂及亚单位疫苗提供依据。 在研究中,首先通过 RT-PCR 特异性扩增编码 N 蛋白基因,然后克隆 至原核表达载体 pET32a+,构建重组表达质粒并转化大肠杆菌 BL21,经 IPTG 诱导获得了高效表达的分子量约为 66KD 的重组蛋白包涵体,且能与 SARS 病人血清发生特异性反应。利用切胶纯化的重组蛋白,本研究又对其 应用进行了初步探索:用纯化后的重组 N 蛋白免疫长耳白兔制备多克隆抗 体,结果表明表达的融合蛋白可刺激机体产生相应抗体;建立间接 ELISA 法对不同来源的 SARS 病人中抗核蛋白抗体 IgM、IgG 进行检测,证实重组 蛋白可作为一种可靠、高效的 ELISA检测试剂加以开发,同时也为找寻抗 体产生的规律提供一些线索。进而,又成功制备了鼠源性抗核蛋白单克隆 抗体。这为进一步对核蛋白及其抗体的性质、功能等研究奠定了良好的基 础。


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