收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

核心蛋白聚糖的基因克隆及其在Pichia Pastoris中的表达和活性测定

郝小夏  
【摘要】:核心蛋白聚糖(decorin,DCN)为蛋白聚糖(PG)的一种,属富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖家族的成员,在调节细胞粘附、迁徙、增殖、胶原纤维形成及对TGF-β活性调节中起重要作用。人DCN核心蛋白基因外显子序列长1080bp,编码395个氨基酸。 目的 建立并利用巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)真核表达系统表达人DCN核心蛋白。 方法 ①利用人DCN核心蛋白的特异引物,通过RT-PCR扩增人DCN核心蛋白基因的cDNA全长,将扩增的人DCN核心蛋白基因与载体pPic9k重组,并转入DH5α进行测序鉴定;②将序列正确的重组体大量扩增后酶切线性化,通过醋酸锂法转入酵母宿主HIS~-/GS115细胞中,然后在含不同浓度G418的YPD平板上筛选阳性克隆;③用含1%甲醇的BMMY培养基诱导表达该蛋白;④在人肝母细胞瘤细胞(HepG2)培养液中加入不同浓度的表达产物,作用一定时间后,观察表达产物对HepG2细胞生长的影响。 结果 ①扩增出的人DCN核心蛋白基因片断测序的结果与GeneBank中的人DCN核心蛋白基因序列对比,序列完全一致,无突变。②构建了真核表达载体pPic9k-DCN,并将酶切线性化的重组载体转入酵母菌HIS~-/GS115后,筛选出了抗高浓度(4mg/ml)G418的阳性克隆,并用PCR法进行了鉴定。③用表达产物对HepG2细胞进行干预的结果表明,表达产物对HepG2细胞增生有抑制作用,并表现出浓度和时间依赖性关系,各剂量组间均有显著性差异(P<0.05),且随着作用时间延长生长抑制作用也增强(P<0.05)。HE染色可见细胞突起回缩,核固缩致密,染色加深,凋亡小体形成,大量肿瘤细胞凋亡。 结论 建立了Pichia Pastoris真核表达系统,表达了人DCN核心蛋白,若进一步优化条件,可纯化出人DCN核心蛋白,为大量表达人DCN核心蛋白奠定了基础,也为DCN生物学活性的研究及肿瘤临床诊治提供必要条件。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王建华,杨学全,王彩华;蛋白聚糖与临床[J];山西医药杂志;2000年01期
2 郭建刚,冯坤;骨性关节炎软骨的生化与代谢变化[J];中国骨伤;1998年05期
3 丛祥凤,刘学文,张英珊;牛主动脉蛋白聚糖对培养的人主动脉平滑肌细胞生长的影响[J];中国动脉硬化杂志;1999年01期
4 马乐群,段德生,许则民;健康中国人股骨头软骨下骨及股骨头缺血性坏死软骨下骨胶原、蛋白聚糖含量的测定及意义[J];吉林医学;1997年04期
5 李王安,周瑞莉,林金涨,陈玮莹;蛋白聚糖与肿瘤发生和发展的关系[J];汕头大学医学院学报;2001年04期
6 王唯析,刘丙方,高尔静,徐群渊;蛋白聚糖在发育期大鼠大脑皮质的表达[J];解剖学报;2004年03期
7 郭明,张英珊,陈国芬;培养的人主动脉平滑肌细胞合成的蛋白聚糖的生化分析[J];中国生物化学与分子生物学报;1988年04期
8 陈国芬,黄文英;动脉粥样硬化发病机理研究[J];中国医学科学院学报;1989年04期
9 刘学文,何兰杰,丛祥凤;同型半胱氨酸对血管内皮细胞合成蛋白聚糖的影响[J];中国分子心脏病学杂志;2003年01期
10 冯小兰;冯震博;;ADAMTS蛋白酶性质的研究进展[J];医学文选;2006年02期
11 丛祥凤,刘学文,张英珊;牛主动脉蛋白聚糖对培养的人脐静脉内皮细胞生长的影响[J];中国动脉硬化杂志;1999年02期
12 陈兵,赵意平,张柏根;移植静脉粥样化与管壁蛋白聚糖关系的实验研究[J];中华医学杂志;2003年08期
13 田海泉;李放;;细胞密度对髓核细胞产生蛋白聚糖影响的体外实验[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年02期
14 曹峻岭;李思远;师钟丽;岳燕;孙健;陈静宏;付强;HUGHES Clare E;CATERSON Bruce;;大骨节病(发生在中国的一种地方性骨关节病)关节软骨代谢[J];西安交通大学学报(医学版);2009年02期
15 丛祥凤,张春玲,张英珊;硫酸乙酰肝素蛋白聚糖对培养人脐静脉内皮细胞合成蛋白聚糖的影响[J];中国生物化学与分子生物学报;1997年02期
16 翟松会;王峥;;蛋白聚糖:与疾病相关的研究新热点[J];西部医学;2007年06期
17 韩秀娴;;眼部蛋白聚糖结构与功能[J];眼科新进展;1983年01期
18 缪明泉,贾杭若,王爱忠,张英珊,杨瑞彪,张振声;渔区年轻人主动脉蛋白聚糖和嗜苏丹病变的定量分析[J];中国动脉硬化杂志;1994年04期
19 叶迅;蛋白聚糖与糖尿病微血管病变[J];国外医学.内分泌学分册;2002年04期
20 邓少嫦;黄韧;;硫酸乙酰肝素蛋白聚糖与阿尔茨海默病[J];中国神经精神疾病杂志;2006年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘颖;;健骨胶囊对骨性关节炎模型兔关节软骨组织中蛋白聚糖含量的影响[A];中华中医药学会中药实验药理分会第六届学术会议论文汇编[C];2006年
2 钱胜君;黄益奖;张宁;陈维善;;乙醇对椎间盘退变的影响及其作用机制研究[A];2009年浙江省骨科学学术年会论文汇编[C];2009年
3 尚政军;;口腔鳞癌中肌萎缩蛋白聚糖的翻译后修饰异常及其机制[A];第五次全国口腔颌面—头颈肿瘤学术研讨会论文汇编[C];2006年
4 刘颖;;健骨胶囊对骨性关节炎模型兔关节软骨组织中蛋白聚糖含量的影响[A];2006第六届中国药学会学术年会论文集[C];2006年
5 曹峻岭;岳燕;孙健;谢龙;李思远;;蛋白聚糖表位和CD44表达与软骨变性坏死[A];第八届全国复合糖生物化学与分子生物学学术会议论文摘要论文集[C];2004年
6 曹峻岭;陈静宏;张增铁;师钟丽;张安;曹珮华;李蔚勃;付强;;KBD相关因素对软骨细胞外基质蛋白聚糖代谢及其调控的影响[A];2008年全国糖生物学学术会议论文摘要[C];2008年
7 张荣峰;张超;阮狄克;;椎间盘细胞的细胞学特性与表型表达研究进展[A];第四届全军腰腿痛学术研讨会、第五届全国肢残康复护理研讨会论文选编[C];2005年
8 姚中强;赵金霞;李茹;栗占国;;Ⅱ型胶原变构肽对胶原性关节炎软骨破坏的抑制作用[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
9 林跃鑫;叶竹秋;黄谚谚;;巴西蘑菇蛋白多糖的分离纯化和理化性质研究Ⅰ[A];全国第6届食用菌学术研讨会论文集[C];2001年
10 张桂珍;操海萍;杨绍娟;高申;卜丽莎;崔亚南;杜珍武;王茜;;结缔组织核心蛋白(Decorin)基因在大肠癌组织中表达的半定量研究[A];第十一届中国体视学与图像分析学术会议论文集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 马衍青;人恶性肿瘤细胞P-selectin分子配基特性的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2003年
2 张莉;壳寡糖、氨基葡萄糖及其衍生物的制备和抗肿瘤活性研究[D];中国海洋大学;2005年
3 潘薛波;番红花球茎蛋白聚糖抗肿瘤研究及其在愈伤组织中的诱导[D];浙江大学;2009年
4 周惠琼;TNF-α、IL-1β及LPS对骨关节炎软骨细胞蛋白聚糖代谢的作用以及菊蒿成分(Parthenolide)的保护作用初探[D];中国协和医科大学;2007年
5 冉鹏;人耳软骨细胞体外培养的实验研究[D];复旦大学;2005年
6 刘钧松;NG2蛋白聚糖糖链生物活性研究夜交藤抑制MMPs改变细胞行为[D];吉林大学;2008年
7 王航;人特异精子膜蛋白hSMP-1基因结构研究[D];中国协和医科大学;1997年
8 高光强;无支架心脏房室瓣膜实验研究[D];中国协和医科大学;1997年
9 金磊;生物瓣钙化机制与羟基铬化学改性作用的研究[D];中国协和医科大学;1995年
10 王晶;经典Wnt/β-catenin信号通路在椎间盘退变中的作用及机制研究[D];华中科技大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 伍刚;持续被动运动对兔膝关节全层软骨缺损修复的影响[D];湖南师范大学;2004年
2 曹译;鹿茸对去卵巢大鼠所致骨质疏松症治疗作用的研究及鹿茸中硫酸软骨素的提取[D];吉林大学;2005年
3 张晋红;糖尿病大鼠肾脏蛋白聚糖Ⅱ(decorin)和转化生长因子-β_1 mRNA的动态变化和关系[D];浙江大学;2003年
4 陈斌;椎间盘炎的实验研究[D];第一军医大学;2000年
5 姚辉;磷脂微胶囊制备技术的研究[D];大连理工大学;2004年
6 张维嘉;激素性ANFH股骨头内有机物骨胶原、蛋白聚糖、脂肪含量的测定及意义[D];佳木斯大学;2007年
7 吴芳;大鼠蛋白聚糖Ⅱ重组腺病毒载体的构建及初步鉴定[D];浙江大学;2004年
8 张春光;犬下颌骨牵张成骨中髁状突软骨改建与细胞外基质变化的实验研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
9 朱锋;蛋白聚糖Ⅱ重组腺病毒载体对高糖环境下大鼠肾系膜细胞细胞外基质mRNA水平的影响[D];浙江大学;2005年
10 常强;退变椎间盘中ADAMTS-4的表达及其意义[D];山西医科大学;2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 余志平;癌症与炎症中的聚糖结构改变探析[N];中国医药报;2005年
2 刘;大蒜提取物可减少动脉脂肪[N];健康报;2005年
3 吴一福;西安交大:用人胎儿软骨细胞培养成功软骨组织工程种子细胞[N];中国医药报;2006年
4 湖南中医药大学第一附属医院国家中医肝病防治中心;肝纤维化指标不正常意味着什么[N];大众卫生报;2007年
5 张骁 束梅英;骨性关节炎药物治疗进展[N];中国医药报;2004年
6 毛远丽;肝纤维化指标不正常≠肝硬化[N];健康报;2006年
7 记者 刘向;大蒜提取物可降低动脉脂肪堆积[N];新华每日电讯;2005年
8 张忠;益气化瘀利水方可抑制骨质增生[N];中国医药报;2006年
9 杭州 李立安;骨性关节炎患者的用药选择[N];家庭医生报;2003年
10 陈列欢;实验鼠干细胞再造人骨关节获新进展[N];医药经济报;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978