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人巨细胞病毒pp65基因片段的原核表达、鉴定以及酵母表达载体的构建

宋玉靖  
【摘要】: 目的选择HCMVpp65基因中能激发CTL和B细胞免疫的优势抗原表位基因pp65(1087—1515nt)基因片段,PCR扩增片段,构建表达载体并在原核细胞中进行功能性表达,进一步鉴定表达蛋白的抗原性;构建酵母pPIC9K-pp65真核表达载体。 方法参考pET-21a(+)载体序列多克隆位点,根据pp65(1087—1515nt)基因序列设计引物,碱性质粒抽提法提取含有HCMVpp65全长基因的pGEM-T-pp65质粒,通过聚合酶链反应(PCR)获得目的pp65(1087—1515nt)基因。PCR产物经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切、T4连接酶连接、蓝白斑筛选构建pET-21a(+)-pp65质粒;经酶切鉴定及核酸序列测定后,将重组质粒转入BL21(DE3)诱导表达;表达的蛋白进行SDS-PAGE电泳并经westernblot鉴定pp65融合蛋白的抗原性;包涵体蛋白经过复性纯化包被聚苯乙烯微量反应板,ELISA法检测pp65融合蛋白的抗原性。参考pPIC9K载体序列多克隆位点,根据pp65(1087—1515nt)基因序列设计引物,以pGEM-T-pp65质粒为摸板,PCR获得目的pp65(1087—1515nt)基因。PCR产物与pMD19-—T simple载体连接,蓝白斑筛选构建的pMD19-—Tsimple-pp65质粒,经酶切、测序鉴定后,以SnaBⅠ和BlnⅠ酶切pMD19-simple-pp65质粒和pPIC9K载体,T4连接酶连接,转化至DH5α感受态细胞。 结果本研究克隆了HCMVpp65(1087—1515nt)基因,成功构建了pET-21a(+)-pp65重组质粒,获得了稳定表达pET-21a(+)-pp65的原核表达体系,western blot和ELISA证实得到了具有抗原活性的pp65融合蛋白片段;此外成功构建了pPIC9K-pp65酵母表达载体。 结论构建了稳定的pET-21a(+)-pp65原核表达体系,获得了具有活性、纯度较高的pp65蛋白片段,此外也成功构建了酵母表达载体pPIC9K-pp65,为大量制备活性pp65蛋白片段、HCMV感染检测试剂的研发和HCMV亚单位疫苗制备提供基础,也为进一步研究pp65的生物学功能奠定实验基础。


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