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体外诱导分化的人脐血间充质干细胞治疗脊髓损伤的实验研究

李静  
【摘要】: 目的:探讨人脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离培养及诱导分化为神经细胞的条件;观察诱导后的MSCs源性神经细胞移植对大鼠脊髓损伤的治疗效果,为治疗中枢神经系统损伤提供实用的细胞来源。 方法:1.体外分离、纯化、扩增脐血MSCs:采用Ficoll分离法分离脐血单个核细胞(mononuclear cells,MNCs),并以低糖DMEM(含10%FBS)培养基接种于6孔培养板中,胰酶消化传代。取传三代的细胞,用流式细胞仪检测细胞表面分子CD11b、CD34、CD45和CD44的表达。2.脐血MSCs的诱导分化:采用脑源性神经营养因子BDNF 10ng/ml+维甲酸RA 0.5μM+碱性成纤维生长因子bFGF 20ng/ml协同诱导培养三代的脐血MSCs定向分化。诱导7d后,用免疫荧光染色法检测星形胶质细胞特异标志GFAP及神经元特异标志MAP2的表达情况。3.体内实验:采用横切法制备大鼠脊髓横断损伤模型,实验大鼠随机分为三组:PBS组、细胞移植组、单纯手术组,每组10只。损伤术后48h,分别于损伤部位注入等量的PBS、Brdu标记的诱导后的细胞,单纯手术组损伤后不施加任何干预作为对照。采用BBB运动功能评分标准在移植术后24h及1、2、3、4、5w各时间点对大鼠进行运动功能评分。用组织学和免疫组化方法检测移植到大鼠脊髓中的Brdu阳性细胞的存活、迁移情况。 结果:脐血MSCs体外培养三代后,细胞表面CD11b、CD34、CD45、CD44表达阴性。诱导分化7d后,大部分细胞的形态类似神经元,免疫荧光染色检测MAP2阳性细胞占大多数,明显多于GFAP阳性细胞。移植后2~5w,细胞移植组大鼠的后肢运动功能恢复情况均好于PBS组和单纯手术组(P<0.05)。免疫组织化学结果显示植入的细胞可长时间在宿主脊髓中存活,并向损伤处两端迁移。 结论:人脐血MSCs于体外在特定的条件下可以诱导分化为神经元样细胞为主体的神经细胞。移植脐血MSCs诱导后的神经细胞可在损伤的宿主脊髓中存活、迁移,并能促进脊髓损伤后行为和功能恢复。


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