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选择性环氧化酶-2抑制剂影响舌鳞癌血管生成的研究

武云霞  
【摘要】: 目的:口腔癌占全身恶性肿瘤发病率的5%,是当前世界上最常见的十大恶性肿瘤之一,其中,90%的口腔癌为上皮源性的鳞状细胞癌。据不完全统计,我国每年约有8000名患者死于本病,尽管包括手术、放疗、化疗在内的各种方法都在不断改进,但口腔鳞状细胞癌(oral squamous carcinoma cell,OSCC)患者的五年生存率仅为50%左右,它严重威胁着人民的生命和健康。近年来口腔癌的发病率不但没有降低,反而有上升且发病年轻化的趋势,因而寻找积极有效的预防途径及有效的药物成为一项十分迫切的重要任务。 血管生成是原发性肿瘤生长、转移及浸润到邻近正常组织的重要环节。实验研究及临床资料表明,肿瘤的生长和转移都依赖于血管生成。与正常血管相比,肿瘤新生血管结构迂曲,血流不规则,通透性增加。大量研究表明,血管生成活性增强与多种恶性肿瘤的不良预后有关,包括口腔癌。血管生成是一复杂的过程,是促血管生成因子和血管稳定因子共同作用的结果,涉及多种途径,最终导致内皮细胞增殖、分化,组成一有功能的血管网。而抑制血管生成过程、从而阻止肿瘤生长已成为实体瘤治疗学研究的新热点。 环氧化酶(COX)是催化花生四烯酸合成前列腺素过程中的重要的限速酶,有2种同工酶:COX-1和COX-2。近期的研究表明,COX-2参与了人类多种肿瘤的发生与发展,在多种肿瘤组织包括头颈部癌中均可检测到COX-2的表达,COX-2抑制剂具有抗肿瘤作用。目前对口腔鳞癌发病中COX-2的作用及血管生成的机制知之甚少,COX-2表达与肿瘤血管新生的相互关系如何,我们还不得而知。本研究拟探讨选择性COX-2抑制剂尼美舒利(Nimesltde,NIM)对人舌鳞癌Yca-8113细胞体外释放PGE_2的影响,同时观察对COX-2和VEGF、Ang-1、Ang-2的抑制作用,以探讨选择性COX-2抑制剂尼美舒利对舌鳞癌血管生成的影响。 方法: 1.放射免疫(radioimmunoassay,RIA)测定尼美舒利对人舌鳞癌Tca-8113细胞体外释放PGE_2的影响 2.采用RT-PCR技术测定不同药物浓度作用后细胞COX-2、VEGF、Ang-1、Ang-2 mRNA的表达情况。 3.采用免疫印迹(Western-blot)法测定细胞COX-2和VEGF、Ang-1、Ang-2的蛋白表达变化。 4.以人舌鳞癌Tca-8113细胞建立荷瘤裸鼠动物模型,分组后预防组以尼美舒利30mg/kg/天于造瘤前一天起每日灌胃,治疗组以尼美舒利30mg/kg/天于成瘤后每日灌胃,对照组以生理盐水每日灌胃,连续36d,观察药物对裸鼠及移植瘤生长的影响。 5.采用RT-PCR技术测定药物作用后裸鼠移植瘤COX-2、VEGF、Ang-1、Ang-2 mRNA的表达情况。 6.采用Western-blot法测定裸鼠移植瘤内COX-2和VEGF、Ang-1、Ang-2的蛋白表达变化。 7.SABC免疫组化法测定34例人口腔鳞癌组织及16例正常口腔黏膜组织中Ang-1、Ang-2、Tie-2、CD34的表达情况。 结果: 1.RIA法检测显示,实验组和对照组细胞培养上清中PGE2基础表达量基本相同,加入尼美舒利后,上清液中PGE_2水平下降,随着药物浓度及干预时间的延长,PGE_2水平下降更为明显,在一定药物剂量和作用时间内呈浓度和时间依赖性。 2.RT-PCR检测COX-2、VEGF、Ang-1、Ang-2mRNA琼脂糖凝胶电泳结果表明,不同浓度的NIM(25、50、100、200μmol/L)处理人舌鳞癌Yca-8113细胞48h后,NIM的各处理组与对照组之间COX-2水平进行比较,差异均有统计学意义(P<0.01);NIM的各处理组与对照组之间VEGF水平进行比较,差异均有统计学意义(P<0.01);NIM的各处理组与对照组之间Ang-1水平进行比较,差异均有统计学意义(P<0.01);NIM的各处理组与对照组之间Ang-2水平进行比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。 3.Western-blot检测COX-2、VEGF、Ang-1、Ang-2蛋白表达显示不同浓度的NIM(25、50、100、200 mol/L)处理人舌鳞癌Tca-8113细胞48h后,NIM的各处理组与对照组之间COX-2蛋白进行比较,经统计学分析各组与对照组间的差异均有统计学意义(P<0.05),50μmol/L组与10μmol/L组相比蛋白表达的量虽有所下降但差异无统计学意义(P>0.05)。COX-2mRNA的表达下降呈浓度依赖性;NIM的各处理组与对照组之间NEGF水平进行比较,经统计学分析各组与对照组间的差异均有统计学意义(P<0.05),50μmol/L组与100μmol/L组相比蛋白表达的量虽有所下降但差异无统计学意义(P>0.05)。VEGF蛋白的表达下降呈浓度依赖性;NIM的各处理组与对照组之间Ang-1水平进行比较,差异有统计学意义(P<0.05),25μmol/L组与50μmol/L组、50μmol/L组与100μmol/L相比蛋白表达的量虽有所下降但差异无统计学意义(P>0.05)。NIM的各处理组与对照组之间Ang-2水平进行比较,差异均有统计学意义(P<0.05),25μmol/L组与50μmol/L组相比蛋白表达的量虽有所下降但差异无统计学意义(P>0.05)。 4.在实验期内3组动物全部存活。3组裸鼠均有舌鳞癌原位移植瘤的生长,其瘤组织经病理切片检查证实为舌鳞癌。 5.裸鼠对照组肿瘤体积为4.2956±2.06cm~3,治疗组肿瘤的体积为2.2661±1.37cm~3,显著小于对照组((P<0.05),肿瘤生长抑制率为47.2%。预防组肿瘤的体积为1.8705±0.87cm~3,显著小于对照组((P<0.05),肿瘤生长抑制率为56.5%。但与治疗组相比,差异无统计学意义。 6.RT-PCR检测裸鼠移植瘤组织中COX-2、VEGF、Ang-1、Ang-2mRNA的表达,NIM预防组、治疗组的COX-2mRNA表达显著下降,经统计学分析与对照组间的差异有统计学意义。而预防组与治疗组之间的差异无统计学意义。NIM预防组、治疗组的VEGFmRNA表达显著下降,经统计学分析与对照组间的差异有统计学意义。而预防组与治疗组之间的差异无统计学意义。NIM预防组、治疗组的Ang-1mRNA表达虽有所下降,但差异无统计学意义。NIM预防组、治疗组的Ang-2mRNA表达显著下降,经统计学分析与对照组间的差异有统计学意义。而预防组与治疗组之间的差异无统计学意义。 7.Western-blot检测裸鼠移植瘤组织中COX-2、VEGF、Ang-1、Ang-2蛋白的表达,NIM预防组、治疗组的COX-2蛋白表达显著下降,经统计学分析与对照组间的差异有统计学意义。而预防组与治疗组之间的差异无统计学意义。NIM预防组、治疗组的VEGF蛋白表达显著下降,经统计学分析与对照组间的差异有统计学意义。而预防组与治疗组之间的差异无统计学意义。NIM预防组、治疗组的Ang-1蛋白表达虽有所下降,但差异无统计学意义。NIM预防组、治疗组的Ang-2蛋白表达显著下降,经统计学分析与对照组间的差异有统计学意义。而预防组与治疗组之间的差异无统计学意义。 8.口腔鳞癌患者CD34阳性细胞表达显著高于正常口腔黏膜者。Ang-1在口腔鳞癌的表达与口腔正常黏膜组比较,无明显差异(P>0.05)。Ang-2在口腔鳞癌的表达明显高于口腔正常黏膜组(P<0.001)。病理分级后各组间比较有统计学意义且与血管生成量呈正相关。说明Ang-2的表达在口腔鳞癌中表达明显上调,并随着肿瘤恶性程度增高其表达水平进一步升高。Tie-2在口腔鳞癌组织的表达明显高于口腔正常黏膜组(P<0.05),但未发现其表达在鳞癌组织各病理分级之间存在明显差异(P>0.05)。 结论: 1.尼美舒利在一定的时间和浓度范围内,呈时间和剂量依赖性抑制体外培养的人舌鳞癌Tca-8113细胞的PGE2的释放。 2.作用48h后,尼美舒利在25-200mmol/L的浓度范围内,可在mRNA和蛋白水平呈浓度依赖性抑制Tca-8113细胞COX-2、VEGF、Ang-1、Ang-2的表达。 3.成功建立了人舌鳞癌Tca-8113细胞裸鼠异体移植瘤模型。 4.在36d的治疗时间内,尼美舒利30mg/kg每日灌胃可显著抑制舌癌裸鼠异体移植瘤的生长。并可在mRNA水平及蛋白水平抑制舌鳞癌的血管生成。 5.尼美舒利对人舌鳞癌体内、外血管生成的抑制作用是COX-2依赖性的。 6.首次观察了尼美舒利对人舌鳞癌Yca-8113细胞裸鼠异体移植瘤的预防作用。 7.Ang-2在口腔鳞癌的表达明显上调,并随着肿瘤恶性程度增高其表达水平进一步升高。其作为肿瘤血管新生的标志之一,可能和口腔鳞癌的血管生成有关。


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