TLR4、CD14在干燥综合征发病中的作用及其机制研究

【摘要】： 干燥综合征(Sjogren's syndrome,SS)是一种主要累及外分泌腺体的慢性炎症性自身免疫病。由于其免疫性炎症反应主要表现在外分泌腺体的上皮细胞,故又名自身免疫性外分泌腺体上皮细胞炎或自身免疫性外分泌病。临床除有唾液腺和泪腺受损功能下降而出现口干、眼干外,尚有其他外分泌腺及腺体外其他器官的受累而出现多系统损害的症状。其血清中则有多种自身抗体和高免疫球蛋白血症。本病分为原发性干燥综合征(PSS)和继发性干燥综合征(SSS)两类,前者指不具另一诊断明确的结缔组织病(CTD)的干燥综合征。后者是指发生于另一诊断明确的CTD如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)等的干燥综合征。本病90%以上为女性,男女之比为1:9～1:20,发病年龄多在40～50岁。国内发病率约为0.3%-0.4%仅次于类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA),已成为严重危害人民健康的常见风湿免疫病。 SS的发病机制至今尚未完全明了,病因可能与遗传、免疫、内分泌和感染等因素有关。与其他自身免疫性疾病一样,SS的正常免疫耐受机制被打破,产生对自身抗原的高滴度的自身抗体是其特点,能够打破人体免疫耐受机制的因素很多,其中细菌感染与自身免疫性疾病的关系,近年来受到广泛重视。 革兰氏阴性菌感染(Gramnegative bacteria,GNB)是人体最常见的感染之一,GNB感染时,细菌和/或脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)即内毒素(Endotoxin)进入血循环,激活多种炎症细胞释放炎性介质,可各种引起炎症反应。 TLR4(Toll like receptor,TLR4)、CD14是LPS应答的主要受体,LPS可以通过Toll样受体信号传导系统介导固有免疫和自身免疫性疾病的发生,因此LPS-TLR4-CD14信号传导通路成为研究自身免疫性疾病的新靶点。 在临床工作中我们也观察到,感染常常是SS发病和复发的诱因。那么感染在SS中发挥怎样的作用呢?LPS-TLR-CD14信号传导通路是否参与了SS的发病?其机制如何?基于上述理论和研究,我们设计了本课题,旨在研究LPS-TLR4-CD14信号通路在SS发病中的作用,进而阐述感染与SS发病的关系,为今后SS的治疗提供新思路。全文分四部分: 第一部分LPS、IL-6、TNF-α在干燥综合征患者血清中的分布及其相关性研究 目的研究干燥综合征患者血清中LPS的水平及其与细胞因子IL-6、TNF-α、ESR的相关性;方法31例干燥综合征患者按照病情分为初发组,缓解组和复发组,初发组根据血沉、CRP进一步分为急性炎症组和非急性炎症组,采用鲎试剂法检测LPS水平;ELISA法检测IL-6、TNF-α;并进行相关性分析;结果①各组干燥综合征患者IL-6、TNF-α水平均高于健康对照组(P＜0.01),初发组与缓解组相比明显增高,差异有统计学意义(P＜0.01)初发组与复发组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);复发组LPS水平明显高于初发组和缓解组,差异有统计学意义(P＜0.01),其余各组相比均无统计学意义。②LPS与相关因素进行直线回归分析显示,PSS患者LPS与IL-6、TNF-α、ESR水平呈正相关(P＜0.05)。③对初发组患者进一步分为急性炎症组和非急性炎症组,比较其各指标水平,急性炎症组和非急性炎症组IL-6、TNF-α水平均高于对照组(P＜0.01);急性炎症组IL-6、TNF-α水平明显高于非急性炎症组(P＜0.01);急性炎症组LPS水平明显高于非急性炎症组(P＜0.01);而非急性炎症组LPS水平与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。结论:①.LPS参与了PSS的发病,感染是PSS患者发病和复发的原因之一;②.IL-6、TNF-α参与了PSS的发病,且其血清中的水平随着PSS病情变化而波动,可以作为临床上观察PSS病情活动指标之一。 第二部分干燥综合征患者外周血淋巴细胞TLR4、CD14的表达 目的探讨干燥综合征患者外周血淋巴细胞TLR4、CD14的表达。方法分别采用RT-PCR法和流式细胞仪检测了TLR4、CD14mRNA和蛋白的表达。结果干燥综合征患者外周血单个核细胞TLR4、CD14mRNA和蛋白的表达均高于对照组(P＜0.05);初发组TLR4、CD14mRNA和蛋白表达水平明显高于缓解组表达水平(P＜0.05);复发组TLR4、CD14mRNA和蛋白表达水平与缓解组表达水平相比明显增高(P＜0.05);病情复发组TLR4、CD14mRNA和蛋白表达水平与初发组TLR4、CD14mRNA和蛋白表达水平相比无统计学意义(P＞0.05)。结论①PSS患者外周血淋巴细胞高表达TLR4和CD14,且与病情活动相一致;②LPS-TLR4信号途径参与了干燥综合征的发病机制。 第三部分干燥综合征患者唇腺组织TLR4、CD14的表达 目的探讨TLR4、CD14与干燥综合征患者唇腺组织损伤的关系。方法采用免疫组化法检测了干燥综合征患者唇腺组织中TLR4、CD14的表达,同时采用RT-PCR法检测唇腺组织中TLR4、CD14mRNA的表达。结果①干燥综合征组高表达TLR4和CD14,对照组TLR4、CD14均无表达;②病理分级为0-1级者,TLR4、CD14的阳性率为62.5%,2级者阳性率为70%,3级者为75%,而4级的唇腺组织破坏严重,TLR4、CD14表达率反而下降为58.3%,各组间TLR4、CD14阳性率差别均具有显著性;③在PSS的唇腺组织中,约64.4%的唇腺导管上皮细胞有TLR4、CD14的表达,约67.8%的淋巴细胞灶中的淋巴细胞表达TLR4、CD14,唇腺导管上皮细胞中TLR4、CD14的表达与淋巴细胞灶中TLR4、CD14的表达差异无统计学意义(P＞0.05);④干燥综合征组TLR4、CD14 mRNA的表达高于对照组(P＜0.05)。结论①干燥综合征唇腺组织高表达TLR4、CD14,TLR4、CD14信号通路可能是造成干燥综合征唇腺组织损伤的原因之一;②导管上皮细胞在SS发病中是主动的参与者,而非被动的受害者,它与唇腺组织中浸润的淋巴细胞一样发挥着重要的生物学效应。 第四部分TLR4、CD14信号传导通路在唇腺上皮细胞中的作用 目的探讨TLR4、CD14信号传导通路在唇腺上皮细胞中的作用。方法体外培养唇腺上皮细胞一周后,①分别于PSS组和对照组加入终浓度为1μg/ml的LPS,在FD培养基中继续培养,并于1h、8h、12h、24h、48h、72h提取细胞总RNA,RT-PCR法检测TLR4、CD14mRNA表达,研究不同时相点LPS对唇腺上皮细胞的作用;②PSS组分别加入终浓度为1ng/ml、10ng/ml、10~2ng/ml、10~3ng/ml、10~4ng/ml、10~5ng/ml LPS,对照组不加LPS,24小时后提取细胞总RNA,RT-PCR法检测TLR4和CD14mRNA表达,研究不同浓度LPS对唇腺上皮细胞的作用;③根据步骤①、②得出的LPS刺激唇腺上皮细胞最有效浓度1μg/ml,最佳时间8h,继续进行实验③的研究:取生长良好的PSS细胞分为三组:1) LPS组:加入终浓度为1μg/ml的LPS;2)阻断组:先加入10μg/ml HTA125培养1小时,然后加入终浓度为1μg/ml的LPS继续培养;3)对照组:不加LPS;37℃,5%CO_2培养箱中培养8小时后收集细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR法检测NF-κBp65mRNA表达;提取细胞核蛋白,采用Western Blot方法检测NF-κBp65蛋白的表达;ELISA法检测细胞培养上清液TNF-α、IL-6含量。结果①对培养细胞进行细胞角蛋白染色,证明所培养细胞来源于唇腺导管上皮细胞;②LPS刺激后1h,TLR4和CD14mRNA表达明显增强,8h达到高峰,此后持续升高至24h后逐渐下降;③1ng/ml浓度的LPS即可引起TLR4和CD14 mRNA表达显著增高,此后随着LPS浓度的增高,表达继续增强,当LPS浓度达到10ng/ml以上时,继续增加LPS浓度,TLR4和CD14 mRNA表达虽仍有增多,但无显著变化。④NF-κBp65mRNA和蛋白表达在LPS组、阻断组和对照组变化一致,结果为:在阻断组细胞表达最弱,与LPS组及对照组细胞相比,差异有显著统计学意义(P＜0.01));LPS组细胞表达最高,与阻断组、对照组相比较,其差异有显著统计学意义(P＜0.01)。⑤细胞培养上清液中TNF-a、IL-6浓度在LPS组、阻断组和对照组变化一致,结果为:在阻断组细胞TNF-α、IL-6表达水平最低,与LPS组及对照组相比,差异有显著统计学意义(P＜0.01));LPS组表达最高,与阻断组、对照组相比较,其差异有显著统计学意义(P＜0.01));结论①唇腺导管上皮细胞高表达TLR4和CD14mRNA,并且在LPS刺激后表达增强,呈浓度依赖性;②LPS-TLR4-CD14-NF-κB-炎症介质,这一信号转导通路参与了SS的发病,进而阐明感染与SS的发病机制有关。