周期联合免疫抑制剂甲氨蝶呤和环磷酰胺治疗诱导型干燥综合征模型的实验研究

【摘要】： [研究背景和目的] 干燥综合征(Sj(o|¨)gren's syndrome,SS)是一种以CD4~+T细胞为主的淋巴细胞高度浸润及破坏外分泌腺的系统性自身免疫性疾病。国内对SS的研究起步较晚,随着诊断手段的提高,患病率有逐年增长的趋势,但仍未被广泛认识,误诊率极高。虽然SS的临床经过较缓慢,但临床表现多样,相当一部分病人可发展为固定性脏器功能损害,除外分泌腺受损外,还可有脑、血液、眼、关节、肌肉、肺、肾、神经、皮肤及消化系统等多种组织和器官病变,部分病人可发展为恶性淋巴细胞增殖,导致患者生活质量显著下降,甚至迅速发展到危及生命的严重程度。值得注意的是,SS治疗研究方面同样存在很大不足,除了一般对症和支持治疗外,目前并没有针对恢复腺体功能的特异性治疗,对于潜在的重症和复杂的外分泌腺外的表现,同系统性红斑狼疮(SLE)一样需要大剂量联合使用免疫抑制剂。 我们借鉴联合化疗治疗白血病的成功经验,根据细胞动力学原理,采用联合小剂量周期特异性[甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)]与周期非特异性[环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)]免疫抑制剂按周期治疗SS,经过十年临床实践,确实观察到腺体分泌功能恢复,疗效显著、副作用小。 本研究通过对诱导型SS动物模型的实验研究,评估不同治疗方案疗效,对比不同治疗方案对炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)]及免疫调节因子[B淋巴细胞激活因子(BAFF)及其受体BR3]基因、蛋白的表达的影响,旨在进一步探讨周期联合MTX和CTX治疗SS可能的分子机制,为重症SS的治疗开辟新途径,为临床有效的治疗方法提供理论依据。 [方法] 1.采用外分泌腺混合匀浆抗原诱导免疫6周龄雌性未孕C57BL/6小鼠,建立SS模型,分别于2、4、6周观察炎症及病理变化过程。 2.6只未造模C57BL/6小鼠作为正常对照(CONTROL_(normal)),36只造模6周C57BL/6小鼠随机分为模型对照组(CONTROL_(SS))和5个不同治疗组,按组分笼饲养,每组各6只。初次免疫后第7周(第43天)开始给药,每3周为一周期,治疗18周。 MTX小剂量组(MTX_(low-dose))相当于临床治疗SS患者(60kg)MTX 7.5mg·w~(-1),大剂量组(MTX_(high-dose))相当于临床治疗SS患者(60kg)MTX 20mg·w~(-1); CTX间歇组(CTX_(pause))相当于临床治疗SS患者(60kg)CTX 400mg·3w~(-1),隔日组(CTX_(qod))相当于临床治疗SS患者(60kg)CTX 200mg·2d~(-1); 联合治疗组为MTX_(low-dose)+CTX_(pause)。 初次免疫设为第1d,至小鼠全部处死,历时24周。 3.从临床症状、病理层面进行疗效研究。 唾液分泌评估炎症过程; 内脏组织病理学观察靶器官损害情况; 腺体组织HE染色评估淋巴细胞浸润程度的病理分级和灶性指数。 4.从蛋白、基因水平进行分子机制研究。 不同时点收集血清、尿液检测全身致炎症性细胞因子TNF-α、IL-1β及免疫调节性细胞因子BAFF蛋白表达水平; 免疫组化法定位测定外分泌腺体细胞内细胞因子TNF-α、IL-1β、BAFF及其受体BR3蛋白表达; 用设定内参照物的方法半定量PCR产物,以比较颌下腺、泪腺局部TNF-α、IL-1β、BAFF及其受体BR3mRNA的表达量。 5.采用SPSS13.0统计软件,计量资料数据以(?)±s表示;率的比较用x~2检验;组间、时点间的比较,采用重复测量的方差分析;多组间、时点间均数的多重比较采用LSD法、DunnettT3法;参数资料相关分析采用Pearson相关,非参数资料采用Spearman相关;药物的交互作用采用析因设计。 [结果] 1.造模情况观察:混合抗原诱导免疫C57BL/6小鼠2周时饮水量增加,检测唾液分泌已明显减少,先于典型病理改变出现;4周出现淋巴细胞中度浸润,腺泡大小不等,腺泡内基底膜明显不均匀增厚,部分腺泡细胞变性、萎缩,数目减少,FS为0～1/4mm~2;6周时病理显示间质中有多灶状淋巴细胞浸润,FS≥1/4mm~2,成模率高达100%,未出现病变的自愈倾向;4周时血清中均可以检测到特异性抗体,成功模拟了人类SS病理变化。 2.治疗后一般情况观察:18周后各治疗组与CONTROL_(SS)组相比唾液分泌量增加(P＜0.01)、饮水量减少,MTX_(low-dose)组唾液分泌量增加最少,接近CONTROL_(SS)组水平;CTX_(qod)组和MTX_(low-dose)+CTX_(pause)组增加趋势较明显。CTX_(qod)组表现体重不增。 3.病理观察及评定:CONTROL_(SS)组腺体中淋巴细胞多灶状浸润,部分腺泡萎缩,数目减少,未出现病变恢复倾向;CTX_(qod)组和MTX_(low-dose)+CTX_(pause)组织形态学表现有很大改善,腺间质中有少量淋巴细胞浸润,导管轻度扩张,未见多灶状淋巴细胞浸润、腺体破坏、纤维增生等。经秩和检验(Wilcoxon W)并结合实际数据,可以认为各组间淋巴细胞浸润程度依次为CONTROL_(SS)≥MTX_(low-dose)≈MTX_(high-dose)≥CTX_(pause)≈MTX_(low-dose)+CTX_(pause)≈CTX_(qod)＞CONTROL_(normal),FS依次为CONTROL_(SS)＞MTX_(low-dose)≥MTX_(high-dose)≥CTX_(pause)≥MTX_(low-dose)+CTX_(pause)≈CTX_(qod)≥CONTROL_(normal)。 4.ELISA法检测细胞外细胞因子蛋白水平,经重复测量的方差分析,治疗后血清、尿液中TNF-α、IL-1β、BAFF表达均减少(P＜0.01),CTX _(qod)组和MTX_(low-dose)+CTX_(pause)组减少最明显。 5.免疫组化法检测组织细胞内细胞因子蛋白定位表达,病理分级为2～3级时表达最强;TNF-α多出现于腺泡和浸润的淋巴细胞中;IL-1β多出现于导管上皮细胞中;浸润的炎性细胞及导管上皮细胞高表达BAFF蛋白,腺泡细胞不表达BAFF;不同组间IHC灰度值有显著差异(P＜0.01):CONTROL_(SS)组呈强阳性,MTX_(low-dose)组、MTX_(high-dose)组、CTX_(pause)组出现较多的中等染色颗粒,MTX_(low-dose)+CTX_(pause)组、CTX_(qod)组弱染。BR3只出现于浸润的淋巴细胞中,各治疗组中染色强度相近,IHC灰度值无显著差别(P＞0.05)。 6.RT-PCR法检测组织细胞内细胞因子基因表达,各治疗组间TNF-α、IL-1β、BAFF表达有差异(P＜0.01),而在不同治疗分组中BR3表达水平无差异(P＞0.05)。 7.相关分析显示24周时BAFF、TNF-α、IL-1β血清/尿液水平、蛋白/基因表达与腺体病理分级、FS评分相关(P＜0.05);BR3蛋白表达与腺体损伤亦呈正相关(P＜0.05),BR3基因表达与腺体损伤不相关(P＞0.05)。 8.2×2析因设计的方差分析表明MTX、CTX存在交互作用,MTX或CTX单独使用使IL-1β、BAFF含量下降,两药联合使用后使下降更明显;MTX、CTX单独使用时唾液分泌增加,两药联合使用后使增加更明显,表现为协同作用。 [结论] 1.混合抗原诱导的SS小鼠模型出现淋巴细胞灶性浸润,炎症因子TNF-α、IL-1β及免疫调节因子BAFF及其受体BR3蛋白表达异常增高,基因表达异常上调;细胞因子水平与外分泌腺体病理及功能损伤均相关; 2.MTX和CTX可以恢复SS小鼠模型腺体功能、改善腺体病理改变、抑制TNF-α、IL-1β、BAFF表达,可能通过影响BAFF信号途径发挥治疗作用; 3.按细胞周期小剂量联合使用MTX和CTX对SS小鼠模型治疗作用优于MTX单用药组及CTX间歇组,与CTX隔日用药组相近;MTX与CTX存在药物交互作用,且为协同效应。