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重组人生长激素和骨髓间充质干细胞移植联合治疗阿霉素性心肌病心力衰竭的实验研究及其机制探讨

李彦红  
【摘要】: 目的: 目前,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成为研究的热点,其在心血管领域的研究大多集中在冠心病及冠心病所致的心力衰竭上,而对于扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)所致心力衰竭的研究尚少,且研究结果报道不一。在对MSCs移植治疗心血管疾病的研究过程中存在MSCs进入体内存活率和分化率低下的问题,所以疗效受到一定程度的影响。本研究分体内和体外两部分,探讨重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)对MSCs的促进作用,观察rhGH与MSCs联合治疗阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠的疗效,并对其可能的机制进行分析,旨在寻找一种既可提高移植MSCs存活率,又不会对机体产生不利影响的药物,为MSCs临床治疗DCM所致心力衰竭提供理论依据。 方法: 1.阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠模型的制作 采用阿霉素腹腔注射的方法(每次2.5 mg/kg,3次/周,用1周,间隔2周,再用1周,共计6次,总剂量15 mg/kg。末次注射完成后观察4周。)制作阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠模型。通过心脏彩色多普勒超声测定左室舒张末内径(LVDD)、左室收缩末内径(LVSD)、左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS);经右颈总动脉插管入左心室,测定左心室收缩压(LVSP)、左室内压力最大上升速率(dp/dt_(max))、左心室舒张末期压力(LVEDP)及左室内压力最大下降速率(—dp/dt_(max));留取心脏标本,测定全心质量指数(HW/BW)及左室质量指数(LW/BW),并观察心腔大小;留取左心室标本行HE染色观察病理变化,鉴定模型制作是否成功。 2.骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外分离、培养、鉴定、诱导分化、标记和超微结构的变化 选7周龄,体重约160-170g左右的Wistar大鼠,采集其双侧股骨、胫骨的骨髓,使用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞;观察其生长特性,待细胞传至第3代时,采用流式细胞仪进行细胞表面抗原CD44、CD45和CD71的测定;取第3代MSCs加入10μmol/l的5—氮胞苷(5—azacytidine,5—Aza)孵育24h进行诱导,分别在诱导后2、3、4周时应用免疫组织化学的方法测定横纹肌肌动蛋白(α—sarcomeric actin)和肌球蛋白重链(MHC)的表达,观察MSCs经5—Aza诱导转化为心肌细胞的情况;并采用流式细胞仪测定MSCs转化为心肌细胞的转化率;同时收集未经5—Aza诱导、5—Aza诱导后2、3、4周时的MSCs,制作标本行电镜检查,通过以上方法鉴定体外培养的细胞是否为骨髓间充质干细胞。移植前,在体外培养的MSCs中加入10mg/l的5—溴脱氧脲嘧啶(BrdU)孵育24h进行细胞标记,用于MSCs进入体内的跟踪。 3.重组人生长激素(rhGH)在体外对MSCs的作用及其机制研究 取生长良好的第2代MSCs细胞,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MMT法)测定不同终浓度(1ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml和500 ng/ml)rhGH作用时MSCs的生长率(或抑制率);取最佳作用浓度(200 ng/ml)的rhGH加入MSCs中,作用不同时间(24、48、72h)MMT法测定MSCs的生长率(或抑制率);采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法测定rhGH作用不同时间(24、48、72h)及去除rhGH作用后不同时间(4d、9d、10d、2周、3周和4周)时,胰岛素样生长因子1(IGF-1)mRNA的表达,来判断rhGH是否通过IGF-1介导促进MSCs生长。 4.rhGH、MSCs移植及rhGH联合MSCs移植治疗对阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠心功能的影响 将实验动物随机分为正常对照组(正常组)6只、心力衰竭对照组(HF组)9只、rhGH治疗组(GH组)6只、MSCs移植治疗组(MSCs组)7只和rhGH+MSCs移植联合治疗组(G+M组)7只。MSCs组和G+M组动物通过心肌局部点状注射(分4点)的方法将100μl(含细胞数约5×10~6个)MSCs移植入左心室心肌内,G+M组动物在MSCs移植前的3天加用rhGH(2mg/kg,隔日1次,皮下注射),MSCs组动物在细胞移植前的3天加用同体积生理盐水皮下注射,隔日1次;GH组动物皮下注射rhGH(2mg/kg,隔日1次),同时行假手术向心肌内注入等量生理盐水;正常组和HF组动物行假手术向心肌内注入等量生理盐水的同时,皮下注射与rhGH同体积的生理盐水,隔日一次,共观察1个月。治疗前后留取静脉血标本测定血清生长激素(GH)和脑利钠肽(BNP)的浓度;治疗1个月后,经右颈总动脉插管入左心室,测定左心室收缩压(LVSP)、左室内压力最大上升速率(dp/dt max)、左心室舒张末期压力(LVEDP)及左室内压力最大下降速率(—dp/dt max);留取心脏标本,测定全心质量指数(HW/BW)及左室质量指数(LW/BW),左心室标本行病理及超微病理结构观察。 5.rhGH与MSCs联合治疗改善阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠心功能的机制研究 应用免疫组织化学的方法检测体外BrdU标记的MSCs在心肌内的存活和分布情况;采用免疫组织化学双染的方法同时检测BrdU(细胞核)和MHC(细胞浆)两种抗原来观察MSCs进入体内是否分化为心肌细胞,及其在心肌内的存活和分布情况;采用MercadierJJ等的方法提取大鼠心肌肌球蛋白,利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离记虻鞍字亓?MHC)同功酶V1型和V3型,观察其各自的变化和相互转化情况;并采用RT-PCR法测定IGF-1mRNA的表达,综合以上因素对rhGH与MSCs联合治疗改善阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠心功能的机制进行分析。 结果: 1.阿霉素性心肌病所致心力衰竭大鼠模型的制作 模型组大鼠的LVDD和LVSD均较正常组增加(5.71+0.27mm vs 4.16±0.20mm,3.17±0.31mm vs 1.07±0.11mm,P<0.01),EF和FS均较正常组降低(76.79±8.56%vs94.51±2.61%,44.52±3.51%vs 74.27±1.80%,P<0.01);LVSP、dp/dt_(max)和—dp/dt_(max)均较正常组降低(14.27±0.98 Kpa vs 15.73±0.25 Kpa、600.67±83.30 Kpa/s vs 731.67±34.96 Kpa/s和469.00±54.11 Kpa/s vs 583.00±32.19 Kpa/s,P<0.05),LVEDP较正常组升高(0.85±0.29Kpa vs -0.07±0.23 Kpa,P<0.05);体重(BW)较正常组减轻(262.00±7.87g vs 303.33±6.11g,P<0.01),HW/BW和LW/BW较正常组增加(3.74±0.29 g/kg vs 2.86±0.10 g/kg和2.91±0.25g/kg vs 2.25±0.15 g/kg,P<0.01);大体标本显示模型组大鼠的心腔较正常组扩大,室壁较正常组变薄,且僵硬;HE染色显示模型组大鼠心肌细胞不同程度的水肿、气球样变,细胞浆染色不均匀,可见炎性细胞浸润。 2.骨髓间充质干细胞(MSCs)的形态、生长方式、鉴定、诱导分化、转化率测定和超微结构的变化 体外培养的MSCs呈贴壁生长,大多数细胞为成纤维样的梭形细胞;细胞表面抗原CD45阴性表达,CD44和CD71呈阳性表达;MSCs经5—Aza诱导后2、3、4周时出现了α—sarcomericactin和MHC的表达,且随时间的延长,阳性表达的MSCs数量增多;MHC mRNA的表达逐渐增加,未经5—Aza诱导、诱导后2、3、4周MHC mRNA的相对含量分别为:0.5497±0.0099、0.8376±0.0202、0.9525±0.0044和1.0352±0.3484,各组间比较,均有统计学差异;MSCs经5—Aza诱导后2、3、4周的心肌细胞转化率均较未诱导组增加;电镜结果显示,未经5—Aza诱导的MSCs细胞核大,双核仁,核周围细胞器少,细胞较原始,而经5—Aza诱导2周后的MSCs即可见到肌丝结构,周围细胞器增多,并可见到高尔基体、线粒体、粗面内质网等多个细胞器,诱导3周和4周时肌丝表达逐渐增多,细胞器也逐渐增多。 3.rhGH在体外对MSCs的作用及其机制探讨 rhGH在10ng/ml浓度以上对MSCs有促生长作用,200ng/ml为最佳促生长浓度,MSCs的生长率为144.74%;200ng/ml的rhGH作用72h时MSCs的生长率为144.10%;无rhGH作用、rhGH作用24h、48h和72h,IGF-1 mRNA的表达逐渐增加(0.4391±0.0058、0.6749±0.0084、0.7781±0.0068和0.8230±0.0060),各组间比较,均有统计学差异;在去除rhGH的作用后,IGF-1 mRNA的表达较rhGH直接作用时减少,但仍随时间的延长逐渐增加,至2周时表达达最高峰,以后逐渐下降(无rhGH作用、去除rhGH作用后4d、9d、10d、2周、3周和4周的IGF-1 mRNA相对含量分别为:0.4391±0.0058、0.5287±0.0077、0.5747±0.0050、0.6068±0.0056、0.7071±0.0089、0.5791±0.0057和0.5781±0.0081)。各组间比较,除去除rhGH作用后第9d、3周和4周三组间比较无统计学差异外,其余各组比较,P均<0.05。 4.rhGH、MSCs移植及rhGH联合MSCs移植治疗对阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠心功能的影响 4.1血液动力学结果GH组大鼠的LVSP和dp/dpmax较HF组升高(16.03±1.33 Kpa vs12.28±2.35 Kpa,687.00±40.95Kpa/s vs 496.17±79.82Kpa/s,均P<0.05),LVEDP和-dp/dpmax与HF组比较,均P>0.05;MSCs组的LVSP、dp/dpmax、LVEDP和-dp/dpmax与HF组比较,均P>0.05;G+M组的LVSP、dp/dpmax和-dp/dpmax与HF组比较均明显升高(19.28±0.95Kpa vs 12.28±2.35 Kpa,824.25±42.79 Kpa/s vs 496.17±79.82Kpa/s,681.75±30.98 Kpa/s vs388.00±45.63 Kpa/s,均P<0.05),LVEDP与HF组比较,P>0.05。 4.2 HW/BW和LW/BW结果HF组HW/BW和LW/BW均较正常组增加(3.54±0.53 vs2.65±0.21,2.66±0.28 vs 2.10±0.21,P<0.05):GH组、MSCs组和G+M组的HW/BW和LW/BW均较HF组降低,但P>0.05;各治疗组间比较,均无统计学差异。 4.3 GH和BNP结果 4.3.1 GH结果治疗前,各组GH水平均较正常组明显降低(1.16±0.58 ng/ml、1.37±0.09ng/ml、1.10±0.50 ng/ml、1.25±0.42 ng/ml vs 2.64±1.03 ng/ml,均P<0.05);治疗后各组的GH水平比较,均P>0.05;各组治疗前后GH水平比较,仅GH组和G+M组较治疗前明显升高(2.50±0.68 ng/ml vs 1.37±0.09 ng/ml,2.48±0.90 ng/ml vs 1.25±0.42 ng/ml,均P<0.05)。 4.3.2 BNP结果治疗前,各组BNP水平均较正常组明显升高(1464.14±151.00 pg/ml、1462.44±242.87 pg/ml、1475.29±281.33 pg/ml、1451.78±180.93 pg/ml vs 1125.02±271.28pg/ml,均P<0.05);治疗后GH组、MSCs组和G+M组的BNP水平较HF组均明显降低(1270.72±203.72 pg/ml、1385.00±250.13 pg/ml、1219.31±126.71 pg/ml vs 1684.46±196.20pg/ml,均P<0.05);各组治疗前后BNP水平比较,仪GH组和G+M组较治疗前明显降低(1270.72±203.72 pg/ml vs 1462.44±242.87 pg/ml,P<0.05:1219.31±126.71 pg/ml vs1451.78±180.93 pg/ml,P=0.001)。 4.4病理结果 4.4.1 HE染色HF组大鼠心肌细胞排列紊乱,不同程度变性坏死,胞浆染色不均匀,可见炎性细胞浸润;经rhGH、MSCs移植及rhGH联合MSCs移植治疗后,心肌细胞数量较HF组不同程度增多,以G+M组增多明显,变性有不同程度的减轻,G+M组变性程度最轻。 4.4.2 VG染色正常组大鼠心肌内可见少量心肌间质纤维;HF组大鼠心肌间质纤维化程度重:经rhGH、MSCs移植及rhGH联合MSCs移植治疗后,心肌间质纤维化均有不同程度减轻。 4.5电镜结果正常组心肌纤维排列整齐,线粒体结构清晰无肿胀;HF组大鼠肌纤维排列紊乱,结构模糊,可见肌纤维断裂,线粒体肿胀明显,部分嵴断裂消失;经rhGH、MSCs移植及rhGH联合MSCs移植治疗后,肌纤维排列较HF组整齐,线粒体肿胀不同程度减轻,数量增多。 5.MSCs与rhGH联合治疗改善阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠心功能的机制 5.1 G+M组大鼠心肌内BrdU标记的MSCs数量明显多于MSCs组,且MSCs转化为心肌细胞的数量也较MSCs组增多。 5.2 HF组的IGF-1 mRNA相对含量较正常组降低(0.5397±0.0111 vs 0.7789±0.0057,P<0.05);GH组、MSCs组和G+M组IGF-1 mRNA相对含量较HF组增高(1.0227±0.0106vs 0.5397±0.0111、0.6518±0.0102 vs 0.5397±0.0111和1.0242±0.0166 vs 0.5397±0.0111,均P<0.05);MSCs组的IGF-1 mRNA相对含量较GH组低(0.6518±0.0102 vs 1.0227±0.0106,P<0.05)。 5.3 GH组的V1型MHC、V3型MHC、V1/V3与HF组比较,均P>0.05;MSCs组的V3型MHC较HF组增加(10.33±0.33 vs 7.43±2.08,P<0.05),而V1型MHC和V1/V3与HF组比较无统计学差异;G+M组的V1型MHC和V3型MHC均较HF组明显增加(86.22±1.73vs 77.47±2.02和12.44±0.31 vs 7.43±2.08,均P<0.05)。各治疗组间比较,MSCs组V3型MHC含量较GH组增加(10.33±0.33 vs 7.42±0.72,P<0.05);G+M组V1型MHC和V3型MHC均较GH组明显增高(86.22±1.73 vs 79.79±3.23、12.44±0.31 vs 7.42±0.72,均P<0.05);G+M组V1型MHC含量较MSCs组增加(86.22±1.73 vs 81.66±1.79,P<0.05)。 结论: 1.阿霉素性心肌病所致心力衰竭大鼠模型的制作是成功的,且可视为DCM模型。 2.体外培养的细胞为MSCs,经5—Aza诱导后可向心肌细胞转化,其转化率较低。 3.rhGH在体外可促进MSCs的生长,其促生长作用需要IGF-1介导来完成。 4.rhGH治疗可改善阿霉素性心肌病所致心力衰竭大鼠的心脏收缩功能,MSCs移植治疗未见明显的改善阿霉素性心肌病所致心力衰竭大鼠心功能的作用,二者联合应用可很好地改善阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠的心脏收缩和舒张功能。 5.rhGH联合MSCs移植治疗可很好地改善阿霉素性心肌病所致心力衰竭大鼠的心功能的机制为:①rhGH在体内促进了MSCs的生长,增加了具有收缩功能的心肌细胞数量;②rhGH和MSCs移植治疗增加了心肌局部IGF-1mRNA的表达,IGF-1促进细胞增殖分化,促进新生血管形成,抑制RAS系统,抑制细胞凋亡,改善心功能;③MSCs数量的增多和rhGH的促进蛋白合成作用共同使心肌MHC含量增加,且以V3型MHC增加为主,增加心肌收缩力,改善心功能。


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