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再灌注期间应用硫化氢对大鼠缺血—再灌注心肌的保护作用及其机制研究

许言午  
【摘要】: 缺血预适应和缺血后适应是公认的对抗心肌缺血-再灌注损伤的有效保护手段,二者具有很多共同的作用机制。但这二者因其应用时间和/或操作上的不便而使其在临床实践中的应用具有很大的局限性。药物预适应和药物后适应通过药物模拟缺血预适应或缺血后适应的保护机制而成为对抗缺血-再灌注损伤的新手段。其中,药物后适应以其时间上的可控性和易操作性而成为治疗缺血-再灌注损伤的重要发展方向。硫化氢(HydrogenSulfide,H_2S)是继一氧化氮(Nitric Oxide,NO)、一氧化碳(Carbon Monoxide,CO)后的第三种气体信号分子,在心血管系统发挥着重要的调节作用。近年的一些研究表明,缺血前给予硫化氢可以产生对大鼠缺血-再灌注心肌的保护作用。但是再灌注期间给予硫化氢是否也具有心肌保护作用则鲜有报道。为此,我们首先从在体心脏、离体心脏和细胞水平研究了再灌注期间应用硫化氢对缺血-再灌注心肌是否具有明确的效应。研究结果表明再灌注期间应用硫化氢可明显减轻大鼠局部心脏缺血-再灌注心肌和H9c2(2-1)细胞缺氧-复氧损伤,其最佳剂量为50μM。同时我们也证明了这种干预在高脂血症大鼠和衰老大鼠心脏局部缺血-再灌注模型上的有效性。 在上述工作的基础上,进一步分析了硫化氢对缺血-再灌注心肌保护作用的产生机制。我们采用H_2S含量测定、CSE(cystathionine-γ-lyase,胱硫醚-γ-裂解酶)活性测定、CSEmRNA定量PCR检测来观察缺血-再灌注、硫化氢干预对H2S/CSE系统的影响,以及PAG(DL-propargylglycine,DL-炔丙基甘氨酸,一种CSE的不可逆性抑制剂)对缺血后适应干预的效应;采用TUNEL、Caspase-3活性检测、AO/EB染色及罗丹明123染色分别在整体和细胞水平观察硫化氢干预的效应与其可能存在的抗凋亡作用的关系;采用全细胞膜片钳技术观察硫化氢对质膜K_(ATP)通道的效应,并结合应用阻断剂分析质膜和线粒体K_(ATP)通道对H_2S心肌保护作用的贡献;采用阻断剂在离体器官和细胞水平分别观察NO、蛋白激酶A(PKA,protein kinase A)、蛋白激酶C(PKC,protein kinase C)、磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphoinositide3-Kinase,IP_3K)与硫化氢干预保护作用的关系。 本研究分两部分: 一、再灌注期间应用硫化氢对大鼠缺血-再灌注心肌的保护作用 目的:观测再灌注期间给予硫化氢是否有对大鼠缺血-再灌注心肌的保护作用,以及产生心肌保护作用的最佳干预剂量。 材料与方法: 1.材料: (1)健康成年Sprague-Dawley远交群大鼠4-5 months体重260-280 g,雄性;健康Sprague-Dawley远交群大鼠,4-5 weeks体重110-130g,雄性;衰老Sprague-Dawley远交群大鼠,22-24 months,体重490-510 g,雄性。 (2)H9c2(2-1)细胞株。 2.方法: (1)实验模型的建立及标本的留取 ①大鼠在体心脏局部缺血-再灌注模型的建立及标本的留取 ②H9c2(2-1)细胞缺氧-复氧模型建立及标本的留取 ③离体大鼠心脏局部缺血-再灌注模型的建立及标本的留取 ④离体大鼠心脏局部缺血-再灌注致心律失常模型的建立 ⑤高脂血症大鼠在体心脏局部缺血-再灌注模型的建立及标本的留取 ⑥衰老大鼠在体心脏局部缺血-再灌注模型的建立及标本的留取 (2)检测指标的测定 ①实验大鼠心脏梗死面积的测定 ②生化指标检测 i.血清肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)含量的测定 ii.血清及培养液上清丙二醛(Maleic Dialdehyde,MDA)含量的测定 iii.心脏灌流液及培养液上清乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)含量的测定 iv.大鼠空腹血清甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol,LDL_C)的测定 ③组织形态学检测 i.心肌组织石蜡切片的HE染色 ii.心肌组织超微结构电镜观察 ④心功能的测定 ⑤再灌注心率失常的测量 结果: 1.再灌注期间应用不同剂量H_2S对在体大鼠心脏局部缺血-再灌注心肌的影响实验共分为6组进行。 (1)假手术组:仅在冠状动脉左前降支(Left Anterior Descending,LAD)下穿线,不结扎,持续210 min。 (2)缺血-再灌注组:可逆性结扎LAD造成心肌缺血30 min,再灌注开始前5 min,经腹腔注射方式给予生理盐水0.5ml,再灌注持续180min。 (3)硫化氢6.25μmol/kg剂量组:将NaHS 6.25μmol/kg溶于0.5 ml生理盐水,于再灌注开始前5 min,经腹腔注射方式给药,再灌注持续1 80 min。 (4)硫化氢12.5μmol/kg剂量组:NaHS剂量为12.5μmol/kg,其余操作同(3)组。 (5)硫化氢25μmol/kg剂量组:NaHS剂量为25μmol/kg,其余操作同(3)组。 (6)硫化氢50μmol/kg剂量组:NaHS剂量为50μmol/kg,其余操作同(3)组。 1.1再灌注期间应用不同剂量H_2S对在体大鼠心脏局部缺血-再灌注心肌梗死面积的影响 1.1.1危险区面积占左心室面积的百分比(AAR/LV比值):各组之间无显著性差异(P0.05),表明各组动物模型的缺血程度大体相当,因而具有可比性。 1.1.2心肌梗死面积占危险区面积的百分比(AN/AAR比值):各不同剂量组心肌梗死区面积占危险区面积的百分比显著小于缺血-再灌注组。硫化氢6.25μmol/kg组、12.5μmol/kg组、25μmol/kg组、50μmol/kg组的心肌梗死区面积占危险区面积百分比分别为37.01±2.74%、31.89±2.45%、26.61±5.51%和18.86±2.57%。与缺血-再灌注组(46.26±3.55%)相比,心肌梗死面积均显著减少,且表现出剂量依赖性。这表明,再灌注期间应用硫化氢对缺血-再灌注心肌具有保护效应;在6.25~50μmol/kg范围内呈剂量依赖性增强。 1.2再灌注期间应用不同剂量硫化氢对在体心脏局部缺血-再灌注大鼠血清CK、MDA含量的影响 各组CK与MDA含量的减少与心肌梗死面积的减小基本平行。与缺血-再灌注组(1.74±0.09 U/ml;5.93±0.81 nmol/ml)相比,CK及MDA含量在6.25μmol/kg剂量组(1.59±0.08 U/ml;5.40±0.81 nmol/ml)、12.5μmol/kg剂量组(1.49±0.11 U/ml:4.73±0.38nmol/ml)、25μmol/kg剂量组(1.22±0.13 U/ml;3.70±0.37 nmol/ml)、50μmol/kg剂量组(1.11±0.09 U/ml;3.07±0.45 nmol/ml)均显著减小(P0.05)。 2.复氧期间应用不同剂量硫化氢对H9c2(2-1)细胞缺氧-复氧损伤的影响实验共分为8组进行 (1)常氧对照组:置37℃95%空气,5%CO_2持续培养5 h。 (2)缺氧-复氧组:置于充满95%N_2和5%CO_2的三气培养箱内缺氧培养3 h,然后再放入充满95%空气、5%CO_2的常氧培养箱内复氧2 h。 (3)硫化氢12.5μmol/L剂量组:置于充满95%N_2和5%CO_2的三气培养箱内缺氧培养3 h,迅速加入硫化氢溶液10μl,使其终浓度为12.5μmol/L,摇匀后将培养皿转入5%CO_2继续培养2 h。 (4)硫化氢25μmol/L剂量组:操作过程同第(3)组,培养液硫化氢终浓度为25μmol/L。 (5)硫化氢50μmol/L剂量组:操作过程同第(3)组,培养液硫化氢终浓度为50μmol/L。 (6)硫化氢75μmol/L剂量组:操作过程同第(3)组,培养液硫化氢终浓度为75μmol/L。 (7)100μmol/L硫化氢剂量组:操作过程同第(3)组,培养液硫化氢终浓度为100μmol/L。 (8)200μmol/L硫化氢剂量组:操作过程同第(3)组,培养液硫化氢终浓度为200μmol/L。 复氧期间应用不同剂量硫化氢对缺氧-复氧H9c2(2-1)细胞培养液上清LDH和MDA含量的影响 与缺氧-复氧组(800±29.81 U/L;5.97±0.90nmol/ml)相比,各剂量组培养液上清LDH及MDA含量均降低。在12.5μmol/L剂量组(466.67±42.16 U/L;2.56±0.25 nmol/ml)、25μmol/L剂量组(161.11±44.31 U/L;1.40±0.29 nmol/ml)、50μmol/L剂量组(61.11±25.09 U/L;0.70±0.39 nmol/ml)LDH及MDA含量呈剂量依赖性减小,与缺氧-复氧组相比均具有统计学差异(P0.05);在75μmol/L剂量组(244.44±58.37 U/L;3.80±1.04 nmol/ml)、100μmol/L剂量组(622.22±80.74 U/L;4.88±0.99 nmol/ml)、200μmol/L剂量组(650±104.88U/L;5.58±0.66 nmol/ml)LDH及MDA含量则成剂量依赖性升高,其中LDH含量在100μmol/L、200μmol/L剂量组,MDA含量在75μmol/L、100μmol/L、200μmol/L剂量组与缺氧-复氧组相比已无统计学差异(P0.05)。这表明,①在复氧期间应用硫化氢对缺氧-复氧H9c2(2-1)细胞具有保护效应;②硫化氢干预的最佳剂量是50μmol/L。 3.再灌注期间应用硫化氢对在体大鼠心脏局部缺血-再灌注心肌保护作用的形态学观察实验分为3组: (1)假手术组:仅在LAD下穿线,不结扎,持续210 min。 (2)缺血-再灌注组:可逆性结扎LAD造成心肌缺血30 min,再灌注开始前5 min,经腹腔注射方式给予生理盐水0.5 ml,再灌注持续180 min。 (3)硫化氢干预组(50μmol/kg):将NaHS 50μmol/kg溶于0.5 ml生理盐水,于再灌注开始前5 min,经腹腔注射方式给药,再灌注持续180 min。 3.1再灌注期间应用硫化氢对在体大鼠心脏局部缺血-再灌注心肌保护作用的病理形态学观察 HE染色结果表明:假手术组,心肌纤维完整,结构清楚,细胞核形态正常,无变性坏死,心肌间质未见炎性细胞浸润。缺血-再灌注组,心肌纤维排列紊乱,心肌细胞呈现大片状坏死,细胞核有浓缩、破裂、溶解、消失现象,可见大量炎性细胞浸润。硫化氢干预组,心肌纤维比较完整,心肌纤维排列较整齐,可见少量炎性细胞浸润。 3.2再灌注期间应用硫化氢对在体大鼠缺血-再灌注心肌保护作用的超微结构观察 电镜观察结果表明:假手术组,心肌肌原纤维排列整齐,肌节明带、暗带清晰可见;线粒体丰富,结构清晰完整,大小形态正常。缺血再灌注组,心肌肌原纤维排列紊乱,肌节结构不清;心肌细胞核肿胀,核膜不完整;线粒体形态异常,肿胀,嵴排列紊乱,嵴断裂、消失形成空泡。硫化氢干预组,心肌肌原纤维排列较整齐,明带、暗带仍可见;心肌细胞核结构正常;线粒体轻度肿胀,膜较完整。 4.再灌注期间应用硫化氢对离体大鼠心脏局部缺血-再灌注心肌的保护作用实验分为3组: (1)假手术组:仅在LAD下穿线,不结扎,台氏液流速8 ml/min,持续灌注210 min。 (2)缺血-再灌注组:可逆性结扎LAD造成心肌缺血30 min,再灌注开始前5 min,经侧管给予台氏液1 ml/min,总流速8 ml/min,再灌注持续180 min。 (3)硫化氢干预组(50μmol/L):将NaHS 400μmol/L溶于20 ml台氏液,于再灌注开始前5 min,经侧管给药1 ml/min,总流速8 ml/min,再灌注持续180 min。 4.1大鼠离体灌流心脏局部缺血-再灌注期间漏出液LDH释放时间序列曲线 再灌注开始后LDH释放逐渐增加,再灌注30 min时LDH释放达高峰,以后随再灌注进行LDH释放逐渐下降。 4.2再灌注期间应用硫化氢对大鼠离体心脏局部缺血-再灌注心肌的保护作用 4.2.1再灌注期间应用硫化氢对大鼠离体心脏局部缺血-再灌注期30 min灌流漏出液LDH的影响 与假手术组相比缺血-再灌注组灌流漏出液LDH显著升高(2526.32±254.66 U/L vs.131.58±38.57 U/L,P0.01)。表明我们成功的建立了离体心脏局部缺血-再灌注模型。与缺血-再灌注组相比硫化氢干预组LDH释放显著降低(501.75±176.35 U/L),二者具有统计学差异(P0.01)。 4.2.2再灌注期间应用硫化氢对大鼠离体局部缺血-再灌注心脏心功能恢复的影响 再灌注3 h末缺血-再灌注组+dp/dtmax(%)、-dp/dtmax(%)、LVSP-LVDP(%)与假手术组相比均显著降低,而HR(%)则显著升高(P均0.01);与缺血-再灌注组相比硫化氢干预组各项指标均显著改善(P0.01或P0.05)。 4.2.3再灌注期间应用硫化氢对再灌注心律失常的影响 与假手术组相比,再灌注15min内,缺血-再灌注组期前收缩(PVB)发生次数(76.83±6.85 vs.14.43±4.13)显著增高(P0.01),提示成功建立了再灌注心律失常模型;与缺血-再灌注组相比再灌注期间应用硫化氢显著减少了PVB发生次数(22.33±9.29),两组相比具有显著统计学差异(P0.01)。 5.再灌注期间应用硫化氢对高脂血症大鼠缺血-再灌注心肌的保护作用 实验分为正常成年大鼠和高脂血症大鼠两大组,每大组又分为3组,分组同3: (1)假手术组:仅在LAD下穿线,不结扎,持续210 min。 (2)缺血-再灌注组:可逆性结扎LAD造成心肌缺血30 min,再灌注开始前5 min,经腹腔注射方式给予生理盐水0.5 ml,再灌注持续180 min。 (3)硫化氢干预组(50μmol/kg):将NaHS 50μmol/kg溶于0.5 ml生理盐水,于再灌注开始前5 min,经腹腔注射方式给药,再灌注持续180 min。 5.1高脂血症大鼠模型的建立 高脂膳食喂饲大鼠8周后,高脂膳食组大鼠血清TG、TC、LDL_C均显著高于对照组(P0.01),说明成功的制备了高脂血症大鼠模型。 5.2再灌注期间应用硫化氢对高脂血症大鼠缺血-再灌注心肌梗死面积的影响 AAR/LV%在各实验组无统计学差异(P0.05):高脂硫化氢干预组AN/AAR%显著低于高脂假手术组(22.96±54 vs.56.98±2.47,P0.01),但与正常硫化氢干预组(46.25±3.55)相比则显著增高(P0.05)。且高脂假手术组AN/AAR%显著高于正常假手术组(15.8±1.92vs.8.86±2.95,P0.05)。 5.3再灌注期间应用硫化氢对高脂血症大鼠缺血-再灌注心肌保护率的影响 与正常硫化氢干预组相比,高脂硫化氢干预组心肌保护率(CPR,%)升高(91.67±1.83vs.88.15±2.91),二者具有统计学差异(P0.05)。说明硫化氢干预对高脂血症大鼠缺血-再灌注心肌具有更强的保护作用。 6.再灌注期间应用硫化氢对衰老大鼠缺血-再灌注心肌的保护作用 实验分为正常成年大鼠和衰老大鼠两大组,每大组又分为3组,分组同3。 6.1再灌注期间应用硫化氢对衰老大鼠缺血-再灌注心肌梗死面积的影响 AAR/LV%在各实验组无统计学差异(P0.05);衰老硫化氢干预组AN/AAR%显著低于衰老假手术组(22.52±1.69 vs.54.65±1.72,P0.01),但与正常硫化氢干预组(46.25±3.55)相比则显著增高(P0.05)。且衰老假手术组AN/AAR%显著高于正常假手术组(15.51±1.28vs.8.86±2.95,P0.05)。 6.2再灌注期间应用硫化氢对衰老大鼠缺血-再灌注心肌保护率的影响 与正常硫化氢干预组相比,高脂硫化氢干预组心肌保护率(CPR,%)升高(91.70±2.00vs.88.15±2.91),二者具有统计学差异(P0.05)。说明硫化氢干预对衰老大鼠缺血-再灌注心肌具有更强的保护作用。 二、再灌注期间应用硫化氢对大鼠缺血-再灌注心肌保护作用的机制 目的:探讨再灌注期间给予硫化氢对大鼠缺血-再灌注心肌保护作用的可能机制。 材料与方法: 1.材料: (1)健康成年Sprague-Dawley远交群大鼠4-5 months体重260-280 g,雄性。 (2)H9c2(2-1)细胞株。 2.方法: (1)实验模型的建立及标本的留取 ①大鼠在体心脏局部缺血后适应模型的建立及标本的留取大鼠在体心脏局部缺血模型建立同第一部分,结扎LAD缺血30 min后,松开结扎线10 sec,再次结扎进行缺血10 sec,依此重复三次,然后持续再灌注3h。 ②H9c2(2-1)细胞缺氧后适应模型的建立及标本的留取H9c2(2-1)细胞缺氧模型建立同第一部分,缺氧3 h后,先复氧(置于充满95%空气、5%CO_2的培养箱内)5 min,再缺氧5 min,依此重复三次,然后再复氧1.5 h。 ③单个心室肌细胞的分离方法 成年大鼠250-300 g,戊巴比妥钠麻醉后剪开颈总动脉放血,开胸,取出心脏,经主动脉逆行灌流,含胶原酶P的灌流液酶解分散后,置于高钾KB液中备用。 ④其余模型的制备及标本的留取同第一部分 (2)检测指标的测定 ①生化指标检测 i.、超氧化物岐化酶(SOD)测定同第一部分; ii.乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)测定同第一部分; iii.H_2S含量及CSE活性测定:采用敏感硫电极法。 ②胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionineγ-synthase,CSE)mRNA表达检测采用实时定量PCR进行检测 ③细胞凋亡检测 i.DNA原位末端缺口标记法(TUNEL)心肌细胞凋亡检测 ii.Caspase-3相对活性检测 iii.吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色检测细胞凋亡 iv.线粒体跨膜电位(△(?)m)检测 ④膜片钳全细胞电流记录方法常规膜片钳全细胞电流记录方法。 结果: 1.再灌注期间应用硫化氢对H2S/CSE系统的影响 将正常成年大鼠随机分为3组,模型制备及给药方式同第一部分:(1)假手术组;(2)缺血-再灌注组;(3)硫化氢干预组(50μmol/kg)。 1.1硫化氢干预对血清H_2S、危险区组织H_2S含量及CSE活性的影响 与假手术组相比,缺血-再灌注组血浆H_2S含量(38.05±1.95μmol/L vs.47.22±3.02μmol/L)、组织H_2S含量(37.69±1.63μmol/g prot vs.48.00±3.51μmol/g prot)及危险区心肌组织CSE的活性(10.57±1.45 nmol/L/min·g prot vs.18.97±2.00 nmol/L/min·g prot)均显著下降(P0.01)。硫化氢干预组血浆H_2S含量及危险区心肌组织CSE的活性分别为43.28±3.24μmol/L、43.77±3.05μmol/g prot和14.01±1.612 nmol/L/min·g prot,与缺血-再灌注组相比均显著提高(P0.01)。 1.2硫化氢干预对危险区心肌组织CSE表达的影响 与假手术组相比,缺血-再灌注组危险区心肌组织CSE表达降低了13%左右,二者具有统计学差异(P0.01)。硫化氢干预组危险区组织CSE表达则显著回升(P0.01),与缺血-再灌注组相比提高了6%。 2.内源性硫化氢在后适应中的作用-PAG对缺血后适应保护作用的影响 2.1 PAG对在体心肌缺血后适应大鼠血清及组织酶学的影响 模型制备如前所述,实验分为4组:(1)假手术组(2)缺血-再灌注组:再灌注开始前15 min,经腹腔注射方式给予生理盐水0.5 ml;(3)缺血后适应组:再灌注开始前15 min,经腹腔注射方式给予生理盐水0.5 ml;(4)PAG组(50 mg/kg):模型制备同(3)。再灌注开始前15 min经腹腔注射PAG(DL-propargylglycine,一种CSE不可逆性抑制剂)0.5ml(50 mg/kg)。 结果表明:与缺血-再灌注组相比,缺血后适应组血清CK(1.23±0.14 U/ml vs.1.74±0.09 U/ml)、组织MDA(9.36±0.51 nmol/mg prot vs.16.02±2.02 nmol/mg prot)显著降低(P0.01),组织SOD(39.97±2.16 U/mg prot vs.26.33±2.21 U/mg prot)显著升高(P0.01)。提示成功建立了大鼠心肌缺血后适应模型。与缺血后适应组相比PAG组血清CK(1.48±0.12 U/ml)显著升高(P0.01)、组织SOD(31.15±2.33 U/mg prot)显著降低(P0.01),MDA(11.18±1.55 nmol/mg prot)升高但二者无统计学差异。上述结果表明PAG部分阻断了缺血后适应的保护作用,提示在缺血后适应的保护作用中有内源性硫化氢的参与。 2.2 PAG对缺氧后适应H9c2(2-1)细胞培养液上清酶学的影响 模型制备如前所述,实验分为4组: (1)常氧对照组; (2)缺氧-复氧组;复氧前0.5 h加入缺氧预平衡的培养液5μl; (3)缺氧后适应组:复氧前0.5 h加入缺氧预平衡的培养液5μl; (4)PAG组(5 mmol/L):复氧前0.5 h加入PAG溶液(溶于缺氧预平衡的培养液)5μl,终浓度为5 mmol/L。 结果表明:与缺氧-复氧组相比缺氧后适应组培养液上清LDH含量(172.41±48.77U/L vs.752.87±50.76 U/L)和MDA含量(3.40±0.46 vs.6.93±0.41 nmol/ml)显著降低(P均0.01);与缺氧后适应组相比PAG组LDH(540.23±35.61 U/L)和MDA(4.80±0.33nmol/ml)显著升高(P均0.01)。说明PAG减弱了缺氧后适应的保护作用,提示缺氧后适应的保护作用中有内源性硫化氢的参与。 3.激活K_(ATP)通道对再灌注期间应用H_2S产生心肌保护效应的贡献 3.1 H_2S对心肌细胞K_(ATP)通道的激动作用 利用膜片钳全细胞记录方法观测H_2S对心肌细胞K_(ATP)通道的作用。H_2S可激活对格列苯脲敏感的稳态的外向膜电流。格列苯脲是细胞膜K_(ATP)通道特异性阻断剂,表明H_2S可直接作用于心肌细胞激动K_(ATP)通道。 3.2 K_(ATP)通道阻断剂对H_2S产生的心肌保护作用的影响 3.2.1 K_(ATP)通道阻断剂对在体心脏再灌注期间应用H_2S产生的心肌保护作用的影响 模型制备及给药方式同第一部分,实验分为5组: (1)假手术组; (2)缺血-再灌注组; (3)硫化氢干预组(50μmol/kg); (4)格列苯脲组(0.3 mg/kg):于再灌注前15 min腹腔注射给予格列苯脲0.5 ml(0.3mg/kg),其余操作同(3); (5)5-HD组(5 mg/kg):操作同(4),给予5-HD(5-hydroxydecanoic acid,一种线粒体K_(ATP)通道阻断剂)溶液0.5ml(5 mg/kg)。 结果表明:与缺血-再灌注组相比,硫化氢干预组血清CK(1.11±0.09 U/ml vs.1.74±0.09 U/ml)、组织MDA(8.77±0.73 nmol/mg prot vs.16.02±2.02 nmol/mg prot)显著降低(P0.01),组织SOD(42.59±4.72 U/mg prot vs.26.33±2.21 U/mg prot)显著升高(P0.01)。与硫化氢干预组相比,格列苯脲组血清CK(1.48±0.12 U/ml)和组织MDA(13.78±2.75nmol/mg prot)显著升高(P0.01或P0.05)、组织SOD(31.15±2.33 U/mg prot)显著降低(P0.01),除SOD外与缺血-再灌注组无统计学差异;5-HD组血清CK、组织MDA、组织SOD分别为(1.56±0.07 U/ml)、(9.91±0.87 nmol/mg prot)和(30.16±3.47 U/mg prot),与硫化氢干预组相比除组织MDA含量外均具有统计学差异(P0.01),与缺血-再灌注组相比除血清CK(P0.01)外均无统计学差异(P0.05)。提示质膜K_(ATP)通道和线粒体K_(ATP)通道均参与了硫化氢干预的保护作用。 3.2.2 K_(ATP)通道阻断剂对离体心脏再灌注期间应用H_2S产生的心肌保护作用的影响 实验分组同3.2.1,给药方式同第一部分,其中格列苯脲终浓度2μmol/L,5-HD终浓度100μmol/L,于再灌注30 min接取灌流漏出液测定。 3.2.2.1 K_(ATP)通道阻断剂对离体缺血-再灌注心脏灌流漏出液LDH的影响 与缺血-再灌注组相比,再灌注15min内硫化氢干预组灌流液LDH(501.75±176.35U/L vs.2526.32±454.66 U/L)显著降低(P0.01)。与硫化氢干预组相比,格列苯脲组灌流液LDH(2456.14±225.83 U/L)著升高(P0.01),与缺血-再灌注组无统计学差异(P0.05);5-HD组灌流液LDH为(1778.95±287.97 U/L),与硫化氢干预组相比具有统计学差异(P0.01),与缺血-再灌注组相比则无统计学差异(P0.05)。 3.2.2.2 K_(ATP)通道阻断剂对离体局部缺血-再灌注心脏心功能恢复的影响 与缺血-再灌注组相比,硫化氢干预组各项心功能指标均明显恢复(P均0.01):与硫化氢干预组相比,5-HD组和格列苯脲组各项心功能指标均恢复呈现不同程度的减低(P0.01或P0.05)。提示质膜K_(ATP)通都和线粒体K_(ATP)通道均参与了硫化氢干预的保护作用。 3.2.2.3 K_(ATP)通道阻断剂对再灌注心律失常的影响 与缺血-再灌注组相比,硫化氢干预组期前收缩(PVB)发生次数(22.33±9.29 vs.76.83±6.85,P0.01)显著减少;与硫化氢干预组相比,格列苯脲组(70.50±14.11)和5-HD组(43.00±7.54)PVB发生次数显著增加(P均0.01)。提示质膜K_(ATP)通都和线粒体K_(ATP)通道均参与了硫化氢干预的保护作用。 3.3 K_(ATP)通道阻断剂对复氧期间应用H_2S产生的细胞保护作用的影响 实验操作同第一部分,实验分为5组:(1)常氧对照组;(2)缺氧-复氧组;(3)硫化氢干预组(50μmol/L);(4)格列苯脲组(2μmol/L);(5)5-HD组(100μmol/L)。 与缺氧-复氧组相比,硫化氢干预组培养液上清LDH含量(94.44±53.40 U/L vs.772.22±32.77 U/L)、MDA(3.30±0.28 nmol/ml vs.6.97±0.40 nmol/m1)显著降低(P0.01)。与硫化氢干预组相比格列苯脲组培养液上清LDH(750.00±27.89 U/L)和MDA含量(6.27±0.72 nmool/ml)显著升高(P0.01),与缺血-再灌注组相比均无统计学差异;5-HD组培养液上清LDH、组织MDA分别为(400.00±29.81 U/L)和(4.63±0.46 nmol/ml),与硫化氢干预组和缺血-再灌注组相比均具有统计学差异(P均0.01)。提示质膜K_(ATP)和线粒体K_(ATP)均参与了硫化氢干预的保护作用。 4.再灌注期间应用H_2S对缺血-再灌注心肌细胞凋亡的影响 4.1再灌注期间应用H_2S对在体缺血-再灌注心肌细胞凋亡的影响操作同第一部分,实验分为3组: (1)假手术组;(2)缺血-再灌注组;(3)硫化氢干预组(50μmol/kg) 4.1.1 DNA原位末端缺口标记法(TUNEL)心肌细胞凋亡检测 假手术组细胞凋亡指数为1.44%±0.14%,缺血-再灌注组心肌的损伤明显,细胞凋亡指数明显增高至19.07%±1.02%。与缺血-再灌注组相比,硫化氢干预组的凋亡指数明显下降9.63%±1.02%(P0.01)。表明再灌注期间应用硫化氢能显著减少缺血-再灌注损伤引起的心肌细胞凋亡。 4.1.2 Caspase-3相对活性检测 与假手术组相比,缺血-再灌注组Caspase-3相对活性明显增高(3.12±0.61 vs.1.00±0.08,P0.01);硫化氢干预组Caspase-3相对活性(1.55±0.29)与缺血-再灌注组相比明显下降(P0.01)。以上结果提示,硫化氢干预能明显抑制再灌注损伤心肌细胞的凋亡,其检测结果与TUNEL法一致。 4.2复氧期间应用H_2S对缺氧-复氧H9c2(2-1)细胞凋亡的影响实验分为3组: (1)常氧对照组;(2)缺氧-复氧组:(3)硫化氢干预组(50μmol/L)。 4.2.1 AO/EB染色法细胞凋亡检测 常氧对照组细胞凋亡指数为3.47%±0.78%,缺氧-复氧组细胞的损伤明显,细胞凋亡指数明显增高至43.07%±4.34%。与缺氧-复氧组相比,硫化氢干预组(26.30%±2.93%)的凋亡指数明显下降(P0.01)。表明复氧期间应用硫化氢能显著减少缺氧-复氧损伤引起的心肌细胞凋亡。 4.2.2罗丹明123染色线粒体膜电位检测 与常氧对照组相比,缺氧-复氧组相对荧光强度明显升高(208.77±15.42 vs.100±9.79,P0.01);硫化氢干预组相对荧光强度为162.57±15.00,与缺氧-复氧组相比明显降低(P0.01)。提示硫化氢干预可能具有缓解缺氧-复氧损伤所至线粒体膜电位降低的作用。 4.2.3 Caspase-3相对活性检测 与常氧对照组相比,缺氧-复氧组Caspase-3相对活性(1.74±0.29 vs.1.00±0.08)明显增高(P0.01);硫化氢干预组Caspase-3相对活性(1.26±0.13)与缺血-再灌注组相比明显下降(P0.01)。以上结果提示,硫化氢干预能明显抑制再灌注损伤心肌细胞的凋亡,其检测结果与AO/EB染色法和线粒体膜电位检测法一致。 5.NO、PKA、PKC、IP_3K阻断剂对H_2S干预心肌保护作用的影响 5.1 NOS、PKA、PKC、IP_3K阻断剂对离体H_2S干预心肌保护作用的影响 实验分为7组: (1)假手术组:(2)缺血-再灌注组;(3)硫化氢干预组(50μmol/L);(4)L-NAME组(100μmol/L);(5)H-89组(0.5μmol/L);(6)GF-109203x组(1μmol/L);(7)LY-294002组(5μmol/L)。 5.1.1 NOS、PKA、PKC、IP_3K阻断剂对离体心脏灌流液LDH的影响 与缺血-再灌注组相比,硫化氢干预组LDH(501.75±176.35 U/L vs.2526.32±454.66U/L)显著降低(P0.01);L-NAME组、H-89组、GF-109203x、LY-294002组的LDH分别为(2581.58±466.01 U/L)、(2449.12±315.27 U/L)、(1249.12±78.40 U/L)、(2392.98±317.79U/L),与硫化氢干预组均具有统计学差异(P均0.01);其中除GF-109203x组外与缺血-再灌注组均无统计学差异。 5.1.2 NOS、PKA、PKC、IP_3K阻断剂对离体灌流心脏心功能影响 与缺血-再灌注组相比硫化氢干预组心功能各项指标均明显好转(P均0.01);与硫化氢干预组相比L-NAME组各项心功能指标均恶化(P0.01);H-89组除HR(%)与硫化氢干预组无统计差异外,其它各项指标均明显恶化(P0.01);GF-109203x组除HR(%)与硫化氢干预组有统计学差异外,其余各项指标未见明显恶化;LY-294002组各项心功能指标均降低,其中HR(%)和+dp/dtmax(%)与硫化氢干预组具有统计学差异(P0.05或P0.01)。 5.1.3 NOS、PKA、PKC、IP_3K阻断剂对离体H_2S干预心律失常的影响 与缺血-再灌注组相比硫化氢干预组期前收缩(PVB)次数(22.33±9.29 vs.76.83±6.85)显著降低(P0.01);与硫化氢干预组相比,各阻断剂组PVB次数无明显增加(P均0.05)。 5.2 NOS、PKA、PKC、IP_3K阻断剂对缺氧-复氧细胞上清LDH含量的影响分组及剂量同5.1。 与缺氧-复氧组比较硫化氢干预组培养液上清LDH(94.44±53.40 U/L vs.772.22±32.77 U/L)显著降低(P0.01);与硫化氢干预组相比其余各组LDH含量均上升,除LY-294002组外其余各组与硫化氢干预组相比均具有统计学差异(P0.01)。 结论: 1.再灌注期间给予适量H_2S能够显著降低缺血-再灌注引起的心肌损伤,改善心功能,减少心律失常的发生频率。这一保护作用的最佳浓度约为50μM。 2.H_2S干预能够更有效的保护高脂血症和衰老大鼠的再灌注心肌,减少缺血-再灌注引起的心肌损伤。 3.H_2S/CSE系统参与了缺血后适应的内源性保护机制。心肌缺血-再灌注损伤使H_2S/CSE系统功能降低,再灌注期间适量应用H_2S可以促进H_2S/CSE系统恢复,进而发挥其心肌保护作用。 4.H_2S可以直接作用于心肌细胞激活质膜K_(ATP)通道;激活质膜K_(ATP)通道和激活线粒体K_(ATP)通道都是H_2S发挥其保护作用的重要途径,但细胞膜K_(ATP)通道具有更重要的作用。 5.再灌注期间应用H_2S可以减少由缺血-再灌注引起的心肌细胞凋亡,是再灌注期间H_2S减轻心肌缺血-再灌注损伤的重要机制。 6.再灌注期间应用H_2S对缺血-再灌注心肌的保护作用还涉及到NO、PKA、PKC、IP_3K等介导的信号转导过程。


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