神经因素对结扎大鼠冠状动脉诱发心肌损伤的影响及机制探讨

【摘要】： 心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)特别是冠状动脉缺血性心脏病(coronary artery disease, CAD )是威胁人类健康的重大疾患。在过去的几十年中,针对CAD的病生理机制,预防、诊断和治疗方法取得了长足进展,但CAD及其并发症的治疗、疗效和死亡率仍是广大临床工作者面临的严峻挑战。除缺血的严重程度不同外,机体对损伤的调节能力是影响CAD预后的另一关键因素。正常心脏活动是在交感和迷走神经的平衡协调下进行的,急性心肌缺血时心脏交感和迷走神经发生明显变化,主要表现为交感活性的显著升高,过量的儿茶酚胺释放,加剧心肌损伤。心脏感觉神经末梢除感受缺血刺激向中枢传递伤害性信号形成痛觉感受外,在心脏感觉神经末梢受到缺血刺激时,心肌组织内是否发生类似神经源性炎症反应?神经肽是否对心肌缺血损伤产生影响?尚无定论。本研究主要通过观察可逆性神经阻断剂和药物去神经对结扎冠状动脉诱发心肌损伤的影响,探讨神经因素特别是感觉神经在急性缺血性心脏病发病机制中的作用。研究主要包括以下三个方面的内容:①、观察结扎大鼠冠状动脉(coronary artery occlusion, CAO)后心肌组织、背根神经节P物质(substance P, SP)及mRNA表达的变化;②、观察罗哌卡因胸段硬膜外阻滞对结扎大鼠冠状动脉后心肌损伤的影响;③、观察辣椒素去神经对结扎大鼠冠状动脉后心肌电活动及心肌损伤的影响。 第一部分结扎大鼠冠状动脉诱发心肌组织、背根神经节P物质及mRNA表达的变化 目的观察结扎大鼠冠状动脉后心肌组织、背根神经节SP及mRNA(preprotachikinin mRNA,β-PPT mRNA)表达的变化,探讨神经源性机制在急性心肌缺血中的作用。 方法健康雄性SD大鼠随机分为假手术组和结扎冠状动脉组,根据结扎冠状动脉后时间点的不同,每组又分为0.5、1、3、6h四个亚组。在预定时间内取大鼠缺血区心肌组织和T1-5背根神经节,采用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)和酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)观察结扎冠状动脉后心肌组织、背根神经节SP表达的变化。采用实时定量PCR(Real time RT-PCR)观察结扎冠状动脉后0.5 h心肌组织和背根神经节β-PPT mRNA表达的变化。 结果 1、免疫组化结果 心脏:SP免疫反应阳性物质主要位于心内膜和心肌层,心外膜血管内皮有强阳性反应。结扎冠状动脉后各时点缺血区心肌组织SP免疫反应阳性物质表达明显增强。背根神经节:SP免疫反应阳性物质在大、中、小细胞及神经纤维均有表达,但主要表达在小细胞及大、中、小细胞的卫星细胞。结扎冠状动脉后各时点背根神经节SP免疫反应阳性物质表达明显增强。 2、ELISA结果 心脏:假手术组各时点间心肌组织SP含量差异无显著性(P0.05)。结扎冠状动脉后各时点缺血区心肌组织SP含量显著升高,同假手术组比较差异显著(P0.05),但各时点之间比较差异无显著性(P0.05)。 背根神经节:假手术组各时点间背根神经节SP含量差异无显著性(P0.05)。结扎冠状动脉后各时点背根神经节SP含量显著升高,同假手术组比较差异显著(P0.05),但各时点之间比较差异无显著性(P0.05)。 3、Real time RT-PCR 以假手术组目的基因的表达量为标准为标准进行校正,结扎冠状动脉后背根神经节β-PPT mRNA的表达明显升高,同假手术组比较差异显著(P0.01);结扎冠状动脉后心肌组织β-PPT mRNA的表达明显升高,同假手术组比较差异显著(P0.05),但显著低于背根神经节β-PPT mRNA的表达(P0.001)。 结论结扎冠状动脉后大鼠心肌组织和背根神经节SP及β-PPT mRNA的表达明显增加,但心肌组织β-PPT mRNA的表达显著低于背根神经节的表达,提示:①、SP参与了急性心肌缺血伤害性信号的中枢传递,心肌缺血时心肌组织内SP表达的升高可能主要来自于感觉神经末梢的释放;②、心脏感觉神经可能通过神经肽的释放参与心肌缺血病理过程的调节。 第二部分罗哌卡因胸段硬膜外阻滞对结扎大鼠冠状动脉诱发心肌损伤的影响 目的观察罗哌卡因胸段硬膜外阻滞(thoracic epidural anesthesia, TEA)对结扎大鼠冠状动脉后心肌细胞凋亡、心肌组织肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)含量的影响,探讨神经因素对结扎大鼠冠状动脉诱发心肌细胞损伤的影响及其机制。 方法健康雄性SD大鼠72只随机分为假手术组、结扎冠状动脉组和结扎冠状动脉+罗哌卡因胸段硬膜外阻滞组。根据结扎冠状动脉后时间点的不同,每组又分为3、6h两个亚组。硬膜外干预组于结扎冠状动脉前15min硬膜外注射1%罗哌卡因15μl,6h组3h时追加10μl,结扎冠状动脉组硬膜外注射等容积生理盐水。预定时间内采血,取缺血区心肌组织。采用比色法测心肌组织caspase-3活性和原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(terminal deoxynucleotiyltransferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)观察心肌细胞凋亡情况, ELISA法测心肌组织TNF-α含量。 结果 假手术组3、6h caspase-3活性、心肌细胞凋亡率、TNF-α含量比较差异无显著性(P0.05);结扎冠状动脉组3、6h各指标明显升高,同假手术组比较差异显著(P0.05),罗哌卡因硬膜外阻滞组3、6h各指标同结扎冠状动脉组比较明显降低(P0.05),但仍高于高于假手术组(P0.05)。 结论罗哌卡因硬膜外阻滞可以减轻结扎大鼠冠状动脉诱发的心肌损伤,提示神经因素在心肌缺血损伤过程中发挥着重要作用。 第三部分辣椒素去神经对结扎大鼠冠状动脉诱发心肌电活动及心肌损伤的影响 目的观察辣椒素去神经对结扎大鼠冠状动脉后心律失常、心肌细胞凋亡、缺血区心肌组织SP含量、心功能变化的影响,探讨感觉神经对缺血后心肌电活动及心肌损伤的影响。 方法健康雄性SD大鼠随机分为对照和辣椒素去神经组。辣椒素去神经组大鼠辣椒素90mg/Kg分三次皮下注射,对照组给予等容积辣椒素溶剂。三次注射完成后7天选择甩尾反射潜伏期明显延长的大鼠进行后续实验。右颈动脉插管后建立心肌缺血模型,根据结扎冠状动脉后时间点的不同,每组又分为3、6h两个亚组。连续记录大鼠心电图,在预定时间内采血、取心肌组织。检测心肌组织caspase-3活性、心肌细胞TUNEL染色阳性率和缺血后6h心肌组织SP含量。另外,从两组动物中各随机抽取6只大鼠,利用Langendorf体外灌流系统观察去神经大鼠结扎冠状动脉后左室主动收缩压(left ventricular developed pressure, LVDP)的变化。 结果 1、注射辣椒素前两组大鼠甩尾反射潜伏期差异无显著性(P0.05)。对照组动物注射辣椒素溶酶前后甩尾反射潜伏期差异无显著性(P0.05);辣椒素去神经组大鼠辣椒素注射后甩尾反射潜伏期较注射前明显延长,差异显著(P0.01)。 3、辣椒素去神经组大鼠结扎冠状动脉后6h缺血区心肌组织SP含量明显下降,与对照组比较差异显著(P0.05)。 4、结扎冠状动脉后30min心律失常的发生率较高。与对照组比较,辣椒素去神经组大鼠结扎冠状动脉后30min内室性异位搏动发生的次数明显增多(P0.001),室速占室性波总数的比例明显升高(P0.05),室颤的发生率明显升高(P0.01),结扎冠状动脉后去神经大鼠死亡率明显升高(P0.01)。 5、辣椒素去神经组大鼠结扎冠状动脉后3、6h caspase-3活性、心肌细胞凋亡率明显升高,与对照组比较差异显著(P0.05),且结扎后6h组各指标明显高于3h组,两时点比较差异显著(P0.05)。 6、结扎冠状动脉前两组大鼠LVDP差异无显著性(P0.05),结扎后两组大鼠LVDP均出现明显下降,各时点LVDP同结扎前相比差异显著(P0.01)。对照组LVDP在结扎20min后逐渐回升,30min时达到一稳定水平直到实验结束。辣椒素去神经大鼠结扎后未见到LVDP的回升趋势,25min后各时点LVDP同对照组比较差异显著(P0.05)。 结论辣椒素去神经大鼠结扎冠状动脉后心律失常和缺血心肌损伤明显加剧,提示辣椒素敏感感觉神经参与急性心肌缺血病理过程的调制,可能产生心肌保护作用。