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氯沙坦对慢性心力衰竭大鼠β_1肾上腺素能受体信号转导通路与心功能的调节及其机制研究

付德明  
【摘要】: 慢性充血性心力衰竭(congestive heart disease,CHF)是冠心病、高血压、心肌病和瓣膜性心脏病等各种类型心血管疾病的终末阶段和共同归宿,现已逐渐成为危害人类健康的主要疾患之一。 目前已明确,导致CHF发生发展的基本病理机制是心室重塑。心室重塑是由一系列复杂的分子和细胞机制导致心肌细胞和心肌间质的结构、功能和表型发生改变。而交感神经-内分泌系统激活是CHF发生发展的中心环节,与CHF进展密切相关。CHF时,由于交感神经系统(sympathetic nervous system, SNS)激活,引起心脏β1肾上腺素能受体(β1-adrenergic receptor,β1-AR)数量减少(受体下调)、与Gs蛋白脱偶联(受体失敏)以及下游信号转导通路的功能发生相应改变。然而,目前尚不知晓这些变化是适应性还是损害性改变。因此,对CHF时β-AR信号转导通路的调节无疑成为保护心功能,延缓心衰进展的治疗关键。 目前国内外的研究主要集中在β受体阻滞剂对CHF时β-AR信号转导通路的调节作用,而关于AT1受体拮抗剂(angiotensin II receptor blockade, ARB)对CHF时β-AR信号转导通路调节作用的研究尚未见报道。国外EBM大型临床试验研究证实ARB能够降低CHF患者的病死率,并可改善心功能分级和提高生活质量。 本课题研究选择性ARB类药物Los对腹主动脉缩窄慢性压力超负荷所致心力衰竭大鼠β1-AR信号转导通路的调节以及对心室重塑的改善作用,并研究其与PI3K-Akt信号转导通路之间的关系,从而探讨ARB类药物改善衰竭心脏功能的可能机制,希望为临床科学应用ARB类药物治疗CHF提供充分的理论依据。 第一部分氯沙坦对慢性心力衰竭大鼠心室重塑和心功能的保护作用目的:研究氯沙坦(Losartan, Los)对腹主动脉缩窄所致慢性心力衰竭大鼠心室重塑的改善和心功能的保护作用以及相关机制。 方法: 1.实验分组:成年雄性Wistar大鼠,随机分为4组,即腹主动脉缩窄(coarctation of abdominal aorta, COA)+Vehicle组,COA+Los组,假手术(sham operated, Sham)+Vehicle组,Sham+Los组;实验组大鼠给予以20mg/(kg·d)的Los灌胃,sham组用等容量双蒸水灌胃。各组大鼠在术后第5周起开始治疗,连续给药8周。各组大鼠于术后12周进行各指标检测; 2.一般状况观察:术后每天观察各组大鼠的呼吸、毛色、活动量、体重等发育状况,每周记录一次体重,观察体重变化并且进行生存分析; 3.采用超声心动图(ultrasound cardiograph, UCG)和心室插管法评估心功能; 4.心室质量指数检测:打开胸腔,快速取出心脏,电子天平准确称量左、右心室,计算左、右心室质量指数(left ventricular mass index,LVMI; right ventricular mass index, RVMI)。 5. RIA法检测心肌组织血管紧张素II(angiotensin II, Ang II)、醛固酮(aldosterone, ALD)含量; 6. ELISA法检测心肌组织肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)含量;RIA法检测心肌组织白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)含量; 7. ELISA法检测心肌组织I型和III型胶原的含量和比值; 8.化学比色法检测心肌组织羟脯氨酸(hydroxyproline, HYP)含量; 9.实验各组大鼠心肌组织形态学改变:常规HE染色,心肌Masson三色染色并计算心肌间质胶原容积分数(collagen volume fraction, CVF),透射电镜观察心肌组织超微结构改变。 结果: 1.一般状况:Sham组大鼠活动自如,饮水、进食均正常;COA+Vehicle组大鼠随实验进程表现活动减少、精神状态较差,术后8周开始出现呼吸急促、少动、进食量减少、体重下降,且随时间进行性加重,至12周末体重明显低于Sham组和药物干预组(P0.05);COA+Los组大鼠的饮食、活动量、体重等状况明显好于COA+Vehicle组。 2. UCG检测实验各组大鼠心脏形态结构和心功能参数:与COA+Vehicle组相比,COA+ Los组大鼠LVEDD等形态结构指标好转[COA+Los组:(6.74±0.52)mm比COA+Vehicle组:(7.52±0.81)mm, P0.05];而心功能[LVEF:COA+Los组:(63.28±4.32)%比COA+Vehicle组:(43.27±4.25)%, P0.05]等指标亦明显好转; 3.血流动力学检测:与COA+Vehicle组相比,COA+Los组大鼠心功能[LVEDP:COA+ Los组:(11.47±5.06)mmHg比COA+Vehicle组:(21.18±6.56)mmHg, P0.01]等指标明显好转; 4.心室质量指数检测:与COA+Vehicle组相比,COA+Los组大鼠LVMI[COA+Los组:(2.41±0.15)mg/g比COA+Vehicle组:(3.12±0.18)mg/g, P0.05]明显好转; 5.心肌组织Ang II和ALD检测:与COA+Vehicle组相比,COA+Los组大鼠心肌组织Ang II [COA+Los组:(60.15±6.22)pg/mgprot比COA+Vehicle组:(92.31±8.31)pg/mgprot, P0.05]水平降低,ALD[COA+Los组:(58.15±4.96)ng/mgprot比COA+Vehicle组:(87.31±8.82)ng/mgprot, P0.05]水平降低; 6.心肌组织炎性细胞因子检测:与COA+Vehicle组相比,COA+Los组大鼠心肌组织TNF-α[COA+Los组:(579.36±52.62)pg/gprot比COA+Vehicle组:(824.31±80.36)pg/gprot, P0.05]水平降低;IL-6[COA+Los组:(49.12±4.06)pg/mgprot比COA+Vehicle组:(65.22±5.82)pg/mgprot, P0.05]水平降低; 7.心肌组织HYP含量检测:与COA+Vehicle组相比,COA+Los组大鼠心肌组织HYP [COA+Los组:(0.31±0.04)μg/mgprot比COA+Vehicle组:(0.52±0.07)μg/mgprot, P0.05]水平降低; 8.心肌组织I型和III型胶原检测:与COA+Vehicle组相比,COA+Los组大鼠心肌胶原含量[I: COA+Los组:(67.25±5.49)ng/mgprot比COA+Vehicle组:(105.96±9.29)ng/mgprot, P0.05;III: COA+Los组:(9.25±0.84)ng/mgprot比COA+Vehicle组:(10.87±0.93)ng/mgprot, P0.05]降低,I型/III型胶原的比值[COA+Los组:(7.27±0.71)%比COA+Vehicle组:(9.83±0.82)%, P0.05]亦降低; 9.实验各组大鼠心肌组织形态学改变: 9.1心肌组织HE染色,常规光镜下观察心肌细胞及心肌间质变化:COA+Vehicle组在镜下可见心肌细胞肥大,核大深染;心肌纤维增粗且排列紊乱,管壁外有少量炎细胞浸润;COA+Los组可见心肌细胞轻度肥大,心肌纤维排列明显好转;Sham组在镜下可见心肌纤维排列整齐,无血管扩张及血管壁增厚等现象; 9.2心肌组织Masson三色染色观察胶原纤维改变:COA+Vehicle组大鼠心肌间质的CVF(18.53±4.12%)明显高于Sham+Vehicle组(5.56±1.44%, P0.05);而COA+Los组大鼠心肌间质的CVF(11.18±2.75%)则低于COA+Vehicle组(P0.05)。 9.3实验各组大鼠心肌超微结构改变:COA+Vehicle组心肌肌原纤维增粗、紊乱,闰盘模糊、断裂,线粒体数量明显增多、不规则形状,呈空泡状或同心圆/髓鞘样改变;COA+Los组心肌组织超微结构有明显改善;Sham组心肌肌原纤维粗细均匀、排列整齐、明暗相间,闰盘、线粒体等结构清晰可见。 结论:Los通过抑制Ang II与AT1-R结合,抑制心肌Ang II和ALD生成,并降低心肌炎性细胞因子水平,从而改善心肌肥厚和胶原重构所致心室重塑,提高心功能,延缓心力衰竭进展。 第二部分氯沙坦对慢性心力衰竭大鼠β1肾上腺素能受体信号转导通路的调节作用及其机制研究 目的:研究氯沙坦(Losartan, Los)对腹主动脉缩窄慢性压力超负荷所致心力衰竭大鼠β1肾上腺素能受体(β1-adrenergic receptor,β1-AR)信号转导通路的调节及其相关机制。 方法: 1.实验分组:成年雄性Wistar大鼠,随机分为4组,即腹主动脉缩窄(COA)+Vehicle组,COA+Los组,假手术(Sham)+Vehicle组,Sham+Los组;实验组大鼠给予以20mg/(kg·d)的Los灌胃,sham组用等容量双蒸水灌胃。各组大鼠在术后第5周起开始灌胃治疗,连续给药8周。各组大鼠于术后12周进行各指标的检测; 2.采用超声心动图(UCG)评估心脏形态改变和心功能; 3.采用心室插管法观察心腔内注射0.1、1.0、10、100pg/g的异丙肾上腺素(ISO)后LVSP、±dp/dtmax、HR的变化; 4. ELISA法检测血浆去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)水平; 5.免疫荧光细胞化学(IFC)检测心肌细胞β1-AR与p-Akt的共表达情况; 6. RT-PCR检测心肌组织β1-AR、β-肾上腺素能受体激酶-1(β-adrenergic receptor kinase-1,β-ARK1)、PI3K-γ、Gi蛋白的mRNA表达; 7. Western blot检测心肌组织β1-AR/β-actin、p-Akt/t-Akt的蛋白表达; 8.免疫组化(IHC)检测β1-AR在心肌、肝脏和肾上腺的表达和分布; 9. RIA法检测心肌组织腺苷酸环化酶(adenyl cyclase, AC)活性/cAMP水平:以不同浓度的β-AR激动剂ISO和AC特异性激动剂Forskolin刺激后cAMP的净生成量(pmol/ mgprotein/min)作为判定AC活性的指标。 结果: 1.一般状况:同第一部分。 2. UCG检测:同第一部分。 3.血流动力学检测:心腔内注射0.1、1.0、10、100pg/g的ISO可剂量依赖性地升高实验各组大鼠的LVSP、±dp/dtmax和HR,其中COA+Vehicle组的增高幅度明显低于Sham+Vehicle组(P0.05),而COA+Los组的增高幅度则高于COA+Vehicle组(P0.05)。 4.血浆NE测定:与COA+Vehicle组相比,COA+Los组大鼠血浆NE[COA+Los组:(682.24±64.66)pg/ml比COA+Vehicle组:(908.24±75.10)pg/ml, P0.05]水平降低;而且血浆NE与LVEF呈负相关(r=-0.92, P0.01),与LVEDP呈正相关(r=0.73, P0.05),与CI呈负相关(r=-0.76, P0.05)。 5. IFC检测心肌细胞中β1-AR与p-Akt的共表达:COA+Los组大鼠心肌细胞中β1-AR与p-Akt的共表达明显高于COA+Vehicle组; 6. RT-PCR检测:与Sham+Vehicle组相比,COA+Vehicle组β1-AR的mRNA表达减少,β-ARK1和PI3K-γ以及Gi蛋白的mRNA表达增高(P0.05);而COA+Los组β1-AR的mRNA表达高于COA+Vehicle组,PI3K-γ以及Gi蛋白的mRNA表达减少(P0.05),而β-ARK1的mRNA表达虽有所减少,但未达统计学意义(P0.05); 7. Western blot检测:COA+Vehicle组β1-AR的蛋白表达明显低于Sham组(p0.05),而COA+Los组β1-AR和p-Akt的蛋白表达则明显高于COA+Vehicle组(p0.05); 8. IHC检测:β1-AR在心肌组织、肝脏、肾上腺中均有表达,COA+Vehicle组β1-AR在各脏器的表达均较Sham+Vehicle组减少(P0.05),而COA+Los组β1-AR在各脏器的表达较COA+Vehicle组升高(P0.05)。 9.心肌组织AC活性/cAMP检测:不同浓度的ISO和Forskolin刺激可使心肌细胞匀浆中的cAMP含量增加,COA+Vehicle组心肌细胞cAMP的净增加量明显低于Sham+Vehicle组,而COA+Los组则明显改善,AC活性明显升高(P0.01)。 结论:长期应用Los能够降低血浆NE水平,有效调节慢性心衰大鼠β1-AR-Gs-AC-cAMP信号转导通路,通过抑制Gi蛋白和PI3K-γ表达进而引起Akt活性增高,提高β1-AR表达(上调)并且促使β1-AR恢复功能性偶联(复敏),提高AC活性和cAMP生成,进而提高衰竭心肌的正性变力和变时性反应,改善心功能,延缓CHF的进展。


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