原代肝癌细胞体外培养化疗敏感实验研究

【摘要】： 原发性肝癌是高发病率和高死亡率的恶性肿瘤之一。化疗是目前治疗肝癌的主要辅助手段之一,但治疗效果仍无显着提高。近年来,应用肿瘤细胞对化疗药敏实验指导个体化用药的研究越来越受到重视。本研究通过体外原代培养肝癌细胞,采用MTT比色法及流式细胞仪法进行化疗药物敏感实验来筛选对肝癌敏感的化疗药物。同时选用同一患者外周血淋巴细胞进行化疗药物的敏感实验,分析肝癌细胞与外周血淋巴细胞化疗药物敏感谱是否一致,通过肝癌细胞原代培养和外周血淋巴细胞体外化疗药物敏感实验为下一步药物敏感实验的临床应用提供理论依据。DLC-1基因是一种肿瘤抑制基因,它的主要功能是在原发性HCC中抑制癌细胞增殖。本研究通过体外原代培养肝癌细胞采用RT-PCR及westblot测定DLC-1基因表达,分析化疗药物应用对DLC-1表达的影响。 目的 化疗药物对原代肝细胞癌敏感性如何。肝癌患者外周血淋巴细胞能否替代肝癌细胞原代培养进行化疗药物敏感性测试。DLC-1与化疗药物的关系及其可能机制。 方法 1.肝癌组织原代培养：选择9例新鲜肝癌标本。标本均经病理检查证实。无菌条件下切取肝癌组织约1.0cm3大小,用PBS液洗涤2-3次,剪成小块,胰酶消化,经200目的尼龙网筛过滤,用RPMI1640培养液置培养箱中培养。 2.外周血淋巴细胞的分离：将患者外周抗凝静脉血5ml加等体积的淋巴细胞分离液,离心分离出淋巴细胞,用Hanks液洗2次,然后用RPMI1640培养液配制成单细胞悬液。 3.接种培养：用RPMI1640培养液培养箱中培养。原代肝癌细胞进行十三种化疗药物敏感实验,选用相对抑制率较高的药物进行肿瘤细胞及外周血淋巴细胞的敏感性测试。 4.MTT比色法药物敏感实验：将上述细胞悬液培养48h加入MTT再培养6小时后加入二甲亚砜使紫蓝色甲臜结晶完全溶解,酶标仪497nm波长处吸光度测吸光度OD值。根据相对抑制率判断药物敏感性。淋巴细胞相对抑制率≥20%者为敏感；肿瘤细胞相对抑制率≥30%者为敏感。 5.细胞周期及凋亡率测定：制成细胞悬液,PBS液洗两遍,无水乙醇固定,调整细胞浓度为1×106个/ml,取0.2ml置试管中加入PI避光染色20min,再离心、PBS清洗后上流式细胞仪,检测癌细胞的细胞凋亡情况。 6. RT-PCR及Westernblot测定HepG-2肝癌细胞系及原代肝癌细胞中加入化疗药物后DLC-1基因表达。 7.结果分析：所有数据均利用SPSS软件处理。 结果 1.9例肝癌标本中有4例培养成功,用B.C.D.E表示。 2.除CTX组外所有实验化疗药物均能不同程度抑制各种肝癌细胞的生长,促进肝癌细胞的凋亡,HepG一2细胞对所有实验化疗药物均显示不同程度的耐药性。化疗药物对肝癌细胞的敏感性存在明显的差异,5-FU.EADM.MMC.DDP的敏感率相对最高,同一肝癌细胞对不同的化疗药物的敏感性不同,差异有统计学意义(P0.05)。同一药物对不同原代肝癌细胞的抑制率不同,差异有统计学意义(P0.05)。 3.原代肝癌细胞及外周血淋巴细胞对化疗药物的敏感性存在明显的个体差异.同一种化疗药物对同一患者癌细胞和淋巴细胞抑制率和凋亡率差异无统计学意义(P0.05),肝癌患者癌细胞和外周血淋巴细胞的抑制率和凋亡率间存在相关关系(P0.05)。 4.IFN-α和5-FU组HepG-2细胞DLC-1的表达水平较对照组和分别单独应用IFN-α、5-FU组明显升高,原代肝癌细胞B、D组DLC-1表达量远大于C、E组(P0.05)。B、D组的原代肝癌细胞加入化疗药物后DLC-1表达明显升高,与原代肝癌细胞比较差异有统计学意义(P0.05)。 结论 1.肝癌细胞对化疗药物的敏感性存在明显的差异。同一药物对不同原代肝癌细胞的抑制率不同,同一肝癌细胞对不同的化疗药物的敏感性不同,肝癌细胞化疗药物敏感实验有一定的临床应用价值。 2.患者外周血淋巴细胞与其肿瘤细胞对化疗药物的敏感性具有正相关性,应用外周淋巴细胞培养化疗药物敏感实验来预测敏感药物有一定的参考价值。 3.原代肝癌细胞加入化疗药物培养后DLC-1表达明显升高,其机制有待于进一步研究,DLC-1基因作为转移抑制相关的基因,有可能在肝癌治疗中发挥重要作用。