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非致死性机械创伤大鼠模型的制备

郭丽  
【摘要】: 研究背景 随着社会经济的发展,机械创伤的发生率逐年上升。严重的机械创伤对人类生命安全和社会经济均构成了威胁,所以,对严重创伤的救治一直是科研及临床治疗关注的焦点。然而,最近的临床报道显示,在某些创伤程度较轻的病例,创伤后在临床观察的24h内一般情况良好,无直接心血管损伤,但出院后,仍可继发心肌梗死或心脏功能减退,甚至导致死亡。因此,加强对非致死性机械创伤患者的关注,是社会发展提出的新的要求。 目前用于制备机械创伤的动物模型,大多是模拟致死性创伤或局部创伤的,均不适应在临床上出现的伤后患者24内一般状态良好、但存在有潜在的心肌损伤(即,非致死性创伤)的病例。本研究的前期实验选用Noble-Collip鼓,以40rpm,持续转动5min制备的大鼠非致死性机械创伤模型发现:所制备的创伤模型于创伤后24h,虽然在体心功能正常,但将这个时间点的心脏取出,进行离体心脏灌流实验发现,大鼠心功能显著降低;创伤后16h时,大鼠心肌细胞发生了显著凋亡。以上结果提示,该模型可能继发心脏功能降低,且心肌细胞凋亡可能是创伤后继发心脏功能降低的原因之一。然而此模型是否能模拟创伤后24h内一般情况良好,无直接心脏损伤,但有可能继发心脏功能降低的临床患者,以及创伤后心肌细胞凋亡的发生规律如何,目前还不清楚。 目的 1.制备大鼠非致死性机械创伤模型,模拟机械创伤后24h内一般情况良好,无直接心脏损伤,但有可能继发心脏功能降低的临床病例。 2.观察非致死性创伤后,大鼠心肌细胞凋亡发生的时间变化规律,为临床选择创伤后心肌损伤的治疗时机提供实验依据。 方法 1.动物及分组 1)选用健康雄性SD大鼠,随机分为2组:A组和B组。 2)A组随机分为4组:伪创伤组、轻度创伤组、中度创伤组和重度创伤组。 3)B组随机分为2组:伪创伤组和中度创伤组;伪创伤组和中度创伤组均按创伤后0h、3h、6h、12h、24h再各自分为5组。 2.动物模型的制备 将大鼠麻醉后放入Noble-Collip鼓(直径30.5cm)中,分别以20 rpm,持续转动5 min,40 rpm,持续转动5min,60rpm,持续转动8 min 45 sec,制备轻、中、重三种不同程度机械创伤模型。 3.指标测定 1)为了评估各组大鼠创伤后24h内一般情况,观察各组大鼠创伤后24h内生存率,利用BL-410生物信号记录分析系统检测大鼠心率(HR)、心电图(ECG)、平均动脉压(MABP)及心脏血流动力学各项指标:左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张压(LVDP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左室最大收缩速率(+dP/dtmax)和左室最大舒张速率(-dP/dtmax)。 2)为了评估各组大鼠创伤后应激反应情况、炎症活动性及心肌细胞损伤情况,用ELISA法测定血清中肾上腺素、超敏C反应蛋白(hs-CRP)和心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量。 3)为了观察创伤大鼠心肌细胞凋亡情况及凋亡的时间规律,对心肌组织进行TUNEL染色和Caspase-3活性检测。 4)为了明确心肌细胞凋亡是否继发于创伤性休克,利用BL-410生物信号记录分析系统检测大鼠创伤后各时间点平均动脉压(MABP)。 5)为了明确心肌细胞凋亡是否继发于肝脏功能损伤,利用Om-nilabTMBS-300全自动生化分析仪,检测大鼠创伤后各时间点血清中谷丙转氨酶(ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLO)浓度,以及白球比(A/G)。 结果 1.轻度创伤组和中度创伤组大鼠24h内一般情况良好,重度创伤组大鼠24h内一般情况差。 轻度组和中度组创伤后24h生存率100%,创伤后0h心脏功能良好,与伪创组相比差异无统计学意义。重度组创伤后24h内6只大鼠死亡5只,创伤后0h心脏功能显著降低,与伪创组相比差异有统计学意义(图1-8,P0.01)。 以上结果提示,重度组不可用来模拟机械创伤后24h内一般情况良好,无直接心脏损伤,但可能继发心脏功能降低的临床患者。 2.轻度创伤组和中度创伤组大鼠血清中肾上腺素和超敏C反应蛋白(hs-CRP)含量均增高,但两组之间无统计学差异。 与伪创组相比,轻度组和中度组创伤后不同时间点血清中肾上腺素和hs-CRP含量均逐步增高,两种蛋白的血清浓度分别于创伤后72h和24h达高峰,差异有统计学意义(图9-12,P0.01),但轻度组和中度组两组之间进行比较,差异无统计学意义(图13、14)。 3.轻度创伤组和中度创伤组血清中心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量均未增高 与伪创组相比,轻度组和中度组创伤后不同时间点血清中cTnI含量均未明显增高(图15、16),即两组心肌细胞未发生显著坏死。 4.创伤后6h,轻度创伤组心肌细胞凋亡未增加,中度创伤组心肌细胞凋亡增加 与伪创组相比,轻度组创伤后6h心肌细胞凋亡未发生明显变化,中度组创伤后6h心肌细胞凋亡显著增加,差异有统计学意义(图17,P0.01)。 以上结果提示,虽然从应激反应和炎症活动性两方面来看,轻度组和中度组损伤程度无显著差别,但从心肌损伤情况来看,中度组创伤后6h心肌细胞发生了显著凋亡。损伤程度较轻度组严重,很有可能继发心脏功能降低。因此,中度组可用来模拟创伤后24h内一般情况良好,无直接心脏损伤,但有可能继发心脏功能降低的临床患者。 5.中度创伤引起的心肌细胞凋亡随时间呈规律性变化 与伪创组相比,中度组心肌组织中凋亡指数(TUNEL法检测)和Caspase-3活性在创伤后随时间逐渐增高,其中,凋亡指数于创伤后12h达高峰,差异有统计学意义(图18,P0.01); Caspase-3活性于创伤后6h达高峰,差异有统计学意义(图19,P0.01)。 6.中度创伤组创伤后平均动脉压(MABP)24h内即恢复至正常 与伪创组相比,中度组MABP仅于创伤后0h短暂降低,差异有统计学意义(图20,P0.01),创伤后3h即恢复。 7.中度创伤组血清中谷丙转氨酶(ALT)含量短暂升高,但肝脏合成功能均正常。 与伪创组相比,中度组创伤后不同时间点血清中ALT含量有短暂升高,于创伤后3h达高峰,差异有统计学意义(图21,P0.01);血清中总蛋白(图22)、白蛋白(图23)和球蛋白浓度(图24),以及白球比(图25)均无明显变化,即肝脏虽有损伤但合成功能正常。 以上结果提示,中度创伤引起的心肌细胞凋亡在创伤后一段时间内随时间延长而增多。且中度组心肌细胞凋亡达高峰时(创伤后6h),MABP已恢复至正常,肝脏合成功能正常,说明中度创伤引起的心肌细胞凋亡并非继发于创伤性休克和肝脏功能降低。 结论 1.利用Noble-Collip鼓,以40 rpm,转动5min制备的大鼠中度创伤模型,可用来模拟机械创伤后24h内一般情况良好,无直接心脏损伤,但有可能继发心脏功能降低的临床病例。 2.以40rpm,5min制备的大鼠中度创伤模型可以引起心肌细胞凋亡,而且凋亡的心肌细胞在创伤后一段时间内随时间延长而增多。提示临床如果能够尽早采取有效措施阻断细胞凋亡发生,将有可能通过减少心肌细胞的丢失,从而减轻继发性心肌损伤。


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