嗜肺军团菌、甲型H1N1流感病毒荧光定量检测技术研究

【摘要】： 目的建立对嗜肺军团菌、甲型H1N1流感病毒快速、特异、灵敏的检测方法,为临床诊断、环境安全监测和进出口检验检疫等提供有效地检测手段。 方法根据国内唯一探针专利技术——复合探针技术原理,找到病原微生物的特异基因序列,并以此为靶序列进行特异引物和探针设计合成,对相应病原微生物进行实时荧光定量检测,并对镁离子浓度、引物浓度、退火温度、荧光探针及淬灭探针用量等影响荧光定量扩增检测的各因素进行系统优化。 结果为获得嗜肺军团菌实时荧光定量PCR检测的阳性对照,我们构建了含mip基因108bp目的扩增片段的重组质粒,经验证实际应用效果良好。建立的实时荧光定量PCR检测方法对嗜肺军团菌检测有阳性结果,对非嗜肺军团菌检测有阴性结果。为提高扩增效率及灵敏度对反应体系及条件进行优化,确定甲酰胺含量为3%,Mg2+浓度5 mmol/L,上下游引物0.5μmol/L,荧光探针0.2μmol/L,淬灭探针0.4μmol/L,53℃退火30s。采用该方法最低可检测到102CFU/ml细菌,在模拟污水检测中,检测灵敏度为102CFU/ml。 为获得甲型H1N1流感病毒实时荧光定量PCR检测的阳性对照,我们构建了含HA基因540bp目的扩增片段的体外转录RNA,经验证使用效果良好。实时荧光RT-PCR定量检测反应体系中,最佳Mg2+浓度为4.0 mmol/L,反转录酶混合物为50U/μl superscriptⅢ与2.0U/μl Taq酶混合,50℃反转录20 min,52℃退火20s。该方法对22株非甲型H1N1流感病毒株进行检测结果均为阴性,对4株甲型H1N1流感病毒样品检测结果均为阳性,经重复性检测CV%值小于5%。最低可以检出10 copies/μl体外转录RNA。在对38份临床样本的检测中,符合率为100%。并筛选出一种效果优良、价格低廉的核酸提取试剂盒。 结论复合探针荧光定量检测技术能有高效、特异、灵敏地定量检测出嗜肺军团菌及甲型H1N1流感病毒,本研究建立的检测方法对疾病快速诊断、环境监测、防生反恐及进出口检验检疫具有重要意义。