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四种miRNA在神经干细胞与运动神经元以及神经干细胞分化过程中的表达研究

王晶晶  
【摘要】: 研究背景:BMSCs是成体非神经组织源性神经干细胞研究最多的一种。目前对于BMSCs定向分化为神经元的分子调控机制仍不清楚,因为miR-124和miR-128在神经系统含量丰富且特异性较高,本实验通过体外诱导BMSCs向神经元分化,观察miR-124和miR-128的表达情况,以了解它们对BMSCs定向分化为神经元过程中发挥的作用。 目的:本部分的研究旨在通过检测BMSCs诱导分化为神经元的过程中miR-124和miR-128的表达情况,从而初步探讨miR-124和miR-128在BMSCs诱导分化为神经元的过程中所发挥的作用。 方法:采用全骨髓培养法体外分离培养获得BMSCs,根据培养细胞的贴壁能力进行纯化,倒置显微镜下观察其形态变化,取传代培养至第三代的BMSCs,其中一部分细胞进行CD71免疫荧光技术检测,另一部分细胞加入诱导分化培养液进行诱导分化。然后应用ABI公司的TaqMan MicroRNA Assays real-time PCR技术,采用两步法,先将总RNA逆转录为cDNA,再检测miR-124和miR-128在BMSCs诱导分化过程中的表达变化。 结果:miR-124在BMSCs分化所得神经元中的表达是未分化时的0.051倍(P0.05);miR-128在BMSCs分化所得神经元中的表达是未分化时的0.070倍(P0.05)。 结论:miR-124和miR-128在BMSCs诱导分化为神经元的过程中可起重着要的调控作用。 研究背景:神经干细胞是一群具有自我更新、自我增殖和多向分化潜能的细胞。NSCs可定向诱导分化为胆碱能神经元;Hox是运动神经元(motor neurons, MNs)在体内发育的关键因子之一,而miR-126可以通过绑定到同源框来调控Hoxa9,因此,我们通过实验来探讨是否miR-126在脊髓运动神经元的发育过程也起相关作用。miR-31是一种胚胎干细胞特异性的niRNA。我们通过培养、分离和诱导脊髓源神经干细胞(spinal cord stem cells, SCSCs)以及采用免疫磁珠分选法分离纯化胚胎脊髓源运动神经元,然后检测miR-126和miR-31在MNs及SCSCs分化过程中的表达情况,从而初步探讨它们在神经干细胞中定向分化过程中的作用。 目的:通过观察miR-126和miR-31在MNs及神经干细胞分化过程中的表达情况,初步探讨它们在神经干细胞定向分化过程中的作用。 方法:采用孕龄17d的胚胎大鼠脊髓组织,分离、培养神经干细胞,传代扩增。对第3代的神经干细胞球进行神经上皮干细胞蛋白(neuroepithelial stem proteins, Nestin)免疫荧光检测。然后,应用诱导因子RA、音猬因子(sonic hedgehog, Shh)、NT-3和BDNF对神经干细胞进行诱导分化。分化两周后,用免疫荧光检测胆碱能神经元特异性标志物胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase, ChAT)的表达。在另外一个实验中,我们用免疫磁珠法分离纯化胚胎脊髓源运动神经元。最后应用ABI公司的TaqMan MicroRNA Assays real-time PCR技术,来观察miR-126和miR-31在MNs及神经干细胞分化过程中的表达情况。 结果:miR-126在SCSCs中的表达是其分化所得胆碱能神经元中的0.142倍。miR-31在SCSCs中的表达是其分化所得胆碱能神经元的0.118倍。miR-126在胆碱能神经元中的表达是在MNs中的0.002倍。miR-31在胆碱能神经元中的表达是在MNs中的56.444倍。Hoxa9在胆碱能神经元中的表达是在MNs中的0.169倍。Shh在MNs中有表达,而在胆碱能神经元中用实时定量PCR无法检测到。 结论:miR-31在胆碱能神经元中较运动神经元高表达说明了我们诱导所得细胞(胆碱能神经元)与目的细胞(运动神经元)之间可能存在差异;miR-126和miR-31在神经干细胞的分化过程中起着重要的调控重要作用;


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