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绿盲蝽气味降解酶相关基因的鉴定及功能初步研究

沈忱  
【摘要】:盲蝽蟓属于半翅目盲蝽科,是我国棉花生产上一类重要害虫,每年在全世界都对棉花产量造成巨大的损失。目前在我国各棉区已发现的棉盲蝽有20余种,其中危害比较严重的种类,有绿盲蝽、中黑盲蝽、苜蓿盲蝽、三点盲蝽和牧草盲蝽。自1997年起,随着Bt棉花的广泛种植,有效地控制了以棉铃虫为主的鳞翅目害虫的危害,棉盲蝽种群发生数量剧增,由棉花的次要害虫上升为主要害虫之一。绿盲蝽已成为我国黄河流域、长江流域棉区危害最严重的优势种群。目前防治盲蝽主要靠化学农药,这不仅容易导致盲蝽抗药性的产生,而且对环境造成了巨大的污染和破坏,这就使得开发绿色环境友好型防治绿盲蝽的新方法和新技术显得尤为重要。目前,通过干扰靶标昆虫的嗅觉过程来对其进行有效控制是昆虫行为调控的研究热点。 昆虫识别配偶释放的性信息素或植物的挥发性气味是通过位于昆虫嗅觉感器中的相关蛋白来实现的,包括气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、嗅觉受体(olfactory receptors,Ors)、气味降解酶(odorant degrading enzymes,ODEs)和嗅觉神经元膜蛋白(sensoryneuron membrane proteins,SNMPs)。昆虫的嗅觉反应包括一系列连续的反应:包括气味分子的结合,气味分子在感器淋巴液内的运输,气味分子与受体的结合,信号的转化,传导与终止。其中,信号的终止在嗅觉反应中起着非常重要的作用,不仅避免了嗅觉器官受到连续的化学刺激同时还减小了信号饱和性的干扰。 本研究以绿盲蝽为研究对象,通过SMART技术成功构建绿盲蝽触角的cDNA文库并进行详细的生物信息学分析,鉴定大量嗅觉相关基因,筛选出气味降解相关基因,结果获得谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因序列共27条,酯酶(EST)基因序列共12条,细胞色素P450氧化还原酶基因序列共31条。同时结合SMARTer RACE技术克隆有关的气味降解酶(ODEs)基因,成功克隆出一个新的绿盲蝽酯酶基因的全长序列,全长1810bp,开放阅读框为1713bp,编码571个氨基酸。对这条序列命名为Aluc EST1,Gene bank登陆号为JQ715614。预测蛋白分子量为分子量63.44Kd,等电点(PI)为5.99。为研究绿盲蝽气味降解酶生物学功能奠定了基础。随后克隆了两个绿盲蝽内参基因,并采用RT-PCR半定量和Real-time QPCR技术解析Aluc EST1在不同组织的表达图谱。研究结果发现,该酯酶基因在绿盲蝽的触角、头、胸、腹、足、翅各部位都有表达。其中在胸腹部的表达量最高,该基因在触角中也有大量表达。同时利用酶与底物的相互作用关系进行酶活力的测定,本研究以α-醋酸萘酯为底物,固蓝RR盐为显色剂反应,测定了Aluc EST1的酶活力为1.224868( m OD·min-1·mg-1)。通过以α-/β-乙酸萘酯为底物,对绿盲蝽酯酶图谱进行分析,结果发现在绿盲蝽的成虫中,能看到两条清晰的条带,并且相同的条带在绿盲蝽的若虫中也可以看到,其中在雄虫中的条带看起来颜色更深,显示雄虫中该酶活性可能更高。 上述研究为系统阐明绿盲蝽嗅觉识别的分子机制以及绿盲蝽的防治奠定一定的理论基础。这可能成为进一步防控田间绿盲蝽的重要理论依据。


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