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Bacillus.sp.bs-1的内切葡聚糖酶在大肠杆菌中的表达研究

秦伟  
【摘要】:纤维素是世界上最丰富的天然有机物,是一种廉价可再生资源,它的开发和利用具有深远的意义。利用纤维素酶降解纤维素是一种有效而环保的途径,而且纤维素酶的应用范围广。因此,对纤维素酶及其应用的研究逐渐成为了人们关注的热点。目前,对内切葡聚糖酶的研究较多。 孙麟完成了一株纤维素酶活性比较高的枯草芽孢杆的菌筛选及分离,对其进行了分子鉴定,并命名为Bacillus. Sp. bs-1,并成功克隆了其内切葡聚糖酶基因。本研究在这基础上,构建不同原核表达载体,并在大肠杆菌中进行了可溶性过表达的研究。本研究的目的是对表达载体进行比较,研究它们的表达效率,同时也对表达条件进行优化,为内切葡聚糖酶的可溶性过表达研究打基础。 本研究成功的构建成了三个不同的表达载体,即pQE-30-C、pET-30a-C、pET-28a-C,并对其表达效果进行了比较。通过摸索适合的表达条件,确定了pET-30a-C、pET-28a-C表达的内切葡聚糖酶的最佳可溶性诱导表达条件。pET-30a-C表达的内切葡聚糖酶在25℃,用1mM的IPTG诱导3小时就可以达到最佳可溶性表达量。pET-28a-C表达的内切葡聚糖酶在25℃,用0.8mM的IPTG诱导5小时能够达到最佳可溶性表达量。对构建的pET-30a-C、pET-28a-C表达的内切葡聚糖酶活性进行了测定,并确定了最适反应条件。pET-30a-C表达的内切葡聚糖酶在底物缓冲液(以CMC-Na为底物,pH7.0)50℃保温30min时酶的活性最高,酶活性为1489U/mL,pET-28a-C表达的内切葡聚糖酶在底物缓冲液(以CMC-Na为底物,pH3.0)55℃保温30min时酶的活性最高,酶活性为683U/mL。用Ni-NTA树脂纯化了pET-30a-C、pET-28a-C表达的内切葡聚糖酶蛋白,得到单一的目的蛋白,并测定了纯化后的内切葡聚糖酶的比活力。pET-30a-C表达的内切葡聚糖酶纯化后的酶的比活力为723U/mg,pET-28a-C表达的内切葡聚糖酶纯化后的酶的比活力为808U/mg。此结果为枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶在工业应用方面提供了理论依据。


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