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基于Halo-Tag技术的高通量药物筛选系统的研究

赵亮  
【摘要】:Halo-Tag蛋白名为卤代烷脱卤素酶,是由微生物紫红红球菌的脱卤素酶演化而来。该酶可把卤代烷烃中的卤素取代基去除,通过置换脱卤素酶活性中心的组氨酸,使得烷基残基可以有效地以共价键形式结合于蛋白上。Halo-tag蛋白可以非常高效地通过共价键与的配体稳定结合,可以与磁珠或其它介质亲和吸附,用于纯化大肠杆菌或哺乳动物细胞的蛋白。 此外,Halo-tag也可以特异性地通过共价键与报告配体或固化配体结合,来对融合蛋白进行荧光检测或固相吸附等试验操作。 依据Halo-Tag技术原理,以结核分枝杆菌脂肪酸合成酶(mtFabH),设计出一系列带有Halo-Tag配基的mtFabH靶向小分子化合物,利用Halo-Tag和Pull-Down技术验证靶向小分子化合物是否与mtFabH结合。结果表明: 1、酶切鉴定和测序以及蛋白表达纯化结果表明目的蛋白mtFabH成功插入原核表达载体pET-32a (+)中,得到浓度较高的纯重组蛋白His-Trx-mtFabH。 2、酶切鉴定和测序以及蛋白表达纯化结果表明目的蛋白Halo-Tag成功插入原核表达载体pGEX-3X中,得到浓度较高的纯重组蛋白GST-Halo-Tag。 3、利用His-Tag PULL-DOWN实验,验证带有Halo-Tag配基的结核杆菌脂肪酸合成酶(mFabH)的靶向小分子化合物与靶标蛋白的相互作用。实验结果与靶标化合物的活性吻合。 根据以上实验结果证明Halo Tag技术可以应用在靶向药物的筛选研究。


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