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牦牛瘤胃木聚糖酶基因簇中基因的克隆与表达分析

王敏  
【摘要】:瘤胃是自然界中降解纤维素能力最强的优良的生物系统之一。这一环境中的微生物为我们开发新基因和酶提供了巨大的资源,因此也成为开发利用生物质能源的研究热点。传统的研究手段是依赖从瘤胃中分离培养而获得木质纤维素降解菌。根据微生物计数的研究,瘤胃中有75%的原核生物是未培养微生物。因此,未培养微生物可能在瘤胃中降解木聚糖的过程中起着非常重要的作用。基因组/元基因组技术是一种独立于纯培养的微生物群体基因组学的分析工具,通过构建牦牛瘤胃未培养细菌的宏基因组文库,直接从中发现大量木质纤维素降解酶的基因/基因簇,从分子水平上研究其降解木质纤维素的机理,为瘤胃微生物资源的开发提供有力的保障。 本研究从本实验室前期已构建好的牦牛瘤胃元基因组BAC文库9600个克隆中筛选木质纤维素降解酶基因/基因簇,获得了121个(1.26%)木聚糖酶阳性克隆,结合其他酶活共得到293个(3.05%)阳性克隆。对这些克隆采用454测序后,对其中的木聚糖酶和木糖苷酶等木聚糖降解相关酶进行分析,与GenBank的蛋白数据库、KEGG数据库以及COG数据库比对,结合Pfam的分析结果和碳水化合物活性酶分析网站CAZy(http://www.cazy.org)的信息,筛选其中编码木聚糖酶的相关基因。从筛选到的未培养微生物木聚糖酶中克隆和表达了一个可能的木聚糖降解基因簇中的相关基因。对它们的酶学性质进行了分析,这些酶的最适反应温度都是40℃,最适反应pH值都是6,这与它们所在的瘤胃环境酶促反应条件是一致的。通过体外实验研究了它们在降解木聚糖时的协同作用,结果显示,α-葡萄糖醛酸酶对木聚糖酶的促进作用非常明显,木糖苷酶对木聚糖酶也有一定的促进作用,这为进一步研究木聚糖降解过程的机理和开发利用木质纤维素奠定了基础。


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