荧光假单胞菌2P24抗生素2，4-DAPG合成基因的相关调控基因phlG的克隆及功能分析

【摘要】：随着人们对农业可持续发展的认识及对化学农药副作用的认识,使植物病害生物防治的研究逐渐得到重视,生物防治以其特有的防治潜力已经成为保障农业可持续发展的重要手段,其中荧光假单胞菌可作为一种对植物病害有较高防治效果的生防制剂,在农业系统中可以提高农业生产率和植物产品品质,因此具有一定的发展前景。许多国家均有报道荧光假单胞杆菌可防治多种植物病害,其防病机制主要是产生某些次生代谢物质,其中抗生物质2,4-二乙酰基间苯三酚(简称2,4-DAPG或phl)的研究越来越受到重视。本文以我国小麦全蚀病自然衰退土壤中分离得到的生防假单胞菌株2P24(Pseudomonads fluorescens)为研究材料,对其2,4-DAPG代谢调控系统中的phlG基因进行解析。 由于抗生素2,4-DAPG合成基因簇phlACBD上游的phlG基因相关资料报道较少,且菌株2P24的phlG与已报道P. fluorescens CHA0的phlG氨基酸同源性很低,仅为58.57%,无法推测菌株2P24的phlG基因与2,4-DAPG合成,转运或代谢的关系。为了解析phlG基因的功能,本试验通过构建菌株2P24的phlG基因内缺失突变体,并利用薄层层析法和液相色谱法检测突变菌株2,4-DAPG和MAPG的变化。试验中还解析了GacS、RsmE基因与phlG基因的调控关系,并测定突变菌株在小麦根部的定殖情况及对小麦生长的影响;研究了2,4-DAPG产生菌与不同种类生防菌混合定殖情况。 对2,4-DAPG产生菌株2P24的phlG基因突变菌进行生长曲线测定、平板拮抗测定和β-半乳糖苷酶检测发现,phlG基因缺失后不影响菌株2P24生长速度,同时也不影响2,4-DAPG的正常表达。薄层层析试验中我们对比发现, phlG基因与2,4-DAPG降解相关,是调控2,4-DAPG降解的重要因子。其次,利用液相色谱测定发现,2,4- DAPG降解后生成了其合成前体MAPG。另外,我们还发现phlG基因的缺失只是减缓了2,4- DAPG的降解速度,据此推测菌株2P24中仍存在其他调控降解2,4- DAPG的基因。为了进一步检测其他重要因子对phlG基因的表达影响,试验中构建了菌株2P24phlG基因的LacZ融合子,并分别缺失GacS基因和RsmE基因,通过β-半乳糖苷酶检测发现GacS基因对phlG基因的表达起正调控作用,RsmE基因则负调控phlG基因的表达。 本试验中还对phlG基因突变后细菌的定殖能力进行了测定,发现phlG基因突变后不改变生防菌定殖能力。生防菌混合定殖试验中检测发现,假单胞菌比枯草芽孢菌更易被种子表面吸附,所以带菌量更大;然而随着植株的生长,枯草芽孢杆菌在根部增长迅速,在根部定殖过程中表现出较强的竞争力。