两个野大麦CBLs基因家族成员的研究

【摘要】：钙调磷酸酶B类蛋白(calcineurin B-like proteins, CBLs)是近年来鉴定出的一类植物所特有Ca~(2+)传感器,最初是从拟南芥中克隆出来的,因与动物的钙调磷酸酶B亚基(CNB)及中枢神经钙感受器(NCS)极其相似而命名;与其互作的蛋白CIPK(CBL-interacting protein kinase)一起在植物特定的生长发育和应答胁迫过程中起重要作用。目前对于CBL的研究主要集中在拟南芥和水稻上,其他植物上的研究相对较少。 野大麦(Hordeum brevisubulatum (Trin.) Link)是禾本科小麦族中一种多年生兼性的优良牧草,在长期进化过程中演化形成了特殊的感知和适应逆境胁迫的机制,具有重要的研究和应用价值。 挖掘野大麦HbCBLs基因并进行功能研究,不仅具有重要的理论意义,而且具有广泛的应用价值,可以为粮食作物抗逆转基因育种提供潜在的有效候选基因。本研究从野大麦中克隆到两个CBLs基因,命名为HbCBL1和HbCBL2,并对其在逆境胁迫下的响应、亚细胞定位及功能等方面进行了分析。主要研究工作与结果如下: 1、HbCBLs基因的克隆与序列分析:利用RT-PCR技术克隆得到HbCBL1和HbCBL2全长cDNA。经软件分析:HbCBL1和HbCBL2均具有CBL特有的Ca~(2+)结合位点,即EF手臂;HbCBL1在N端具有N-豆蔻酰化位点。 2、通过构建HbCBLs与GFP基因的融合表达载体,分别利用基因枪转化法转化洋葱表皮细胞和花粉浸醮的方法转化野生型拟南芥,Confocal观察表明,HbCBL1定位在质膜和核中,HbCBL2定位在液泡膜上。 3、利用Northern blot分析HbCBLs在干旱胁迫处理下的表达情况。在没有任何处理时,HbCBL1和HbCBL2都有少量的本底表达,且根中表达强于叶。在PEG6000和甘露醇处理下,HbCBL1和HbCBL2随着处理时间的延长表达开始减弱。 4、为了探索HbCBLs的生物学功能,构建超表达载体,农杆菌介导转化野生型和突变体拟南芥,获得了多个转基因株系。目前已筛选至T2代。