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饲料及原料中转基因大豆检测技术的研究

田芳  
【摘要】:饲料行业是转基因作物产品的第一大用户,为了完善转基因产品标识制度的实施,急需建立科学有效、简便快速的饲料转基因成分检测方法。本研究旨在从核酸水平和蛋白水平对转基因大豆、豆粕和不同类型的配合饲料产品进行定性和定量检测;并通过干热处理、湿热处理和挤压膨化试验,研究了温度、湿度和压力对转基因大豆中内、外源基因以及外源蛋白含量的影响,为规范转基因饲料加工工艺及其安全性评价提供科学依据,主要结果如下: 1.对SDS法和CTAB法进行改良,并与试剂盒法进行比较,确定改良SDS方法能够高效快速地提取深加工饲料及其产品中转基因大豆的基因组DNA,质量和纯度均高于改良CTAB法和试剂盒法。 2.通过普通PCR方法扩增转基因大豆的品系特异性基因,表明饲料及原料中的转基因大豆属于GTS 40 - 3 - 2品系;采用LAMP方法对转基因饲料及原料中的CP4 - EPSPS基因进行快速检测,灵敏度至少为普通PCR方法的100倍;以转基因大豆内源基因Lectin,CaMV 35S启动子和CP4 - EPSPS抗草甘膦基因作为检测对象,建立了两套(Lectin 1 / 35S / CP4、Lectin 2 / 35S / CP4)转基因饲料产品的三重PCR检测体系,灵敏度分别为0.25 %和0.5 %;选用含有8个目的基因的标准质粒分子pTLE8替代阳性标准物质,绘制了内源基因Lectin和外源基因CP4– EPSPS的荧光定量PCR标准曲线,R~2 0.99,具有良好的精密度和重复性,CP4 - EPSPS基因的定量低限为1.57拷贝,该体系能够满足不同类型转基因饲料产品的定量检测需求。 3.利用原核表达系统重组表达CP4 - EPSPS基因,经SDS - PAGE电泳分析,表明CP4 - EPSPS重组蛋白在上清中表达量较高,经过纯化、透析、冻干后,获得CP4 - EPSPS蛋白抗原,大小约为50 kDa,并制备了效价为1:729000的CP4 - EPSPS多克隆抗体。 4.建立了转基因饲料产品的Western Blot和ELISA检测系统,筛选并优化了各项参数,检出限分别为0.5 %和0.25 %,具有较高的灵敏度和准确性。13份饲料产品经Western Blot检测,都有杂交信号出现,表明都含有CP4 - EPSPS蛋白;间接ELISA结果表明饲料原料中转基因蛋白的含量较高,加工产品中转基因蛋白的含量较低。 5.以转基因豆粕的Lectin基因和CP4 - EPSPS基因的特定区域为模板,分别设计4对嵌套式引物,对经过干热、湿热和挤压膨化处理的豆粕分别进行定性和定量PCR检测。结果表明不同加工方式会在不同程度上造成豆粕内外源基因的降解,118 bp大小的Lectin基因片段和155 bp大小的CP4 - EPSPS基因片段在高温高压高湿条件下较稳定;CP4 - EPSPS基因降解程度较小;高含水率会在一定程度上缓解内外源基因的降解。Western Blot和间接ELISA结果表明膨化豆粕中均含有CP4 - EPSPS蛋白,其含量随着温度和含水率的升高逐渐降低,变化规律与DNA降解规律一致。


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