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TCDCA对佐剂性关节炎模型大鼠的治疗作用及其作用机制研究

刘明强  
【摘要】:类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性自身免疫性疾病,伴随着复杂的炎症介质导致关节的损害、滑膜炎症、软骨和骨的损坏,导致人类和动物严重的机体功能障碍。尽管RA的病因及发病机制尚未完全明确,但其主要的病理过程环节基本清楚,即免疫功能失调、关节滑膜组织增殖增厚、软骨与骨破坏等三个方面。目前尚缺乏真正有效而副作用小的治疗药物,因此,寻找作用显著、副作用小的天然活性成分逐渐成为RA药物的研究热点。 牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholic Acid, TCDCA)是动物胆汁酸中具有生物活性的主要有效成分之一,从动物胆汁酸中分离提取纯化的TCDCA对动物机体的急、慢性炎症均有显著的抑制作用;对机体的体液免疫、细胞免疫和吞噬功能均有显著的调节作用。在前期研究的基础上,本研究以佐剂性关节炎(adjuvant arthritis, AA)大鼠为对象,观察了具有较高抗炎免疫调节活性的TCDCA的抗类风湿性关节炎作用,同时从影响AA模型发展的关键细胞因子和核转录因于-κB (NF-κB)活性方面探讨了其治疗AA模型可能的药理作用机制,为将其开发为治疗RA的新药奠定实验基础。 本课题的主要研究内容包括以下五个方面: (1)AA模型大鼠的建立与评价 通过比较常用关节炎动物模型的诱导方法,本研究优化筛选出了高成功率、临床症状典型、稳定的诱导AA模型的方法。通过关节炎动物模型的评价标准,本试验建立的AA模型大鼠,造模15d时模型大鼠的对侧脚踝关节、足跖部出现明显的肿胀、四肢爪子表面出现红斑、尾根明显肿胀结节,对侧脚的肿胀率达到25.15%,随着时间的延长对侧脚踝关节、足跖部肿胀率不断增大;造模30d时大鼠的四肢严重肿胀、尾巴出现明显结节,关节炎指数达到14.25,对侧脚的肿胀率达到48.09%,X-ray拍片显示骨骼之间界限模糊,骨密度降低,踝关节部和趾部软组织明显增厚。通过3次重复试验显示,本实验建立的AA模型较为稳定,成功率均在80%以上。 (2) TCDCA对AA模型大鼠的治疗作用 AA模型大鼠连续灌胃给药高低剂量TCDCA (0.2g/kg.b.w、0.1g/kg.b.w)14d后,根据模型评价标准对给药前后的关节炎动物模型进行了评价。结果:模型大鼠锐减的体重得到显著性的恢复,增重率分别由25.57%提高到44.41%、46.02%;模型大鼠四肢及尾根呈现的红斑、肿胀得到一定程度的缓解,关节炎指数分别由13.38降为10.44、10.03;模型大鼠对侧脚肿胀率分别由50.17%降为47.96%、45.83%。通过X-ray观察,模型大鼠两后肢踝关节和趾部骨骼的明显肿大,趾部各骨骼之间界限模糊,骨密度降低,踝关节部和趾部的软组织明显增厚等特征均得到一定程度的减轻。以上结果显示TCDCA对AA模型大鼠呈现出良好的治疗作用。 (3) TCDCA对AA模型大鼠体内关键细胞因子的影响 通过ELISA法和RT-PCR技术分别检测了AA模型大鼠血清和滑膜组织中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10蛋白和mRNA水平的表达。结果,分别灌胃给药AA模型大鼠高低剂量TCDCA (0.2g/kg.b.w,0.1g/kg.b.w)14d和31d后,TCDCA可显著的抑制AA大鼠血清中过度分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白和滑膜组织中mRNA水平的表达(P0.05);高剂量(0.2g/kg.b.w) TCDCA连续给药31d后可显著的提高模型大鼠血清中IL-10的含量和滑膜组织mRNA水平的表达量(P0.05)。 (4) TCDCA对AA模型大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)和腹腔巨噬细胞(PMΦ)中关键细胞因子的影响 采用组织块培养法获得形态典型、单一的FLS细胞。采用ELISA法检测了AA模型大鼠FLS细胞上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10蛋白的含量,同时采用RT-PCR法测定了相应细胞因子mRNA水平表达的变化。结果:TCDCA (300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL)均可显著的抑制AA模型FLS细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的含量(P0.05),而对IL-10蛋白则无显著性的影响(P0.05); TCDCA (300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL)可显著抑制FLS细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6基因的表达量(P0.05), TCDCA (500μg/mL)显著上调IL-10基因的表达量(P0.05)。 采用PBS腹腔灌洗法获得高纯度的PMΦ细胞;采用ELISA法测定了AA大鼠PMΦ细胞上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10蛋白的含量;采用RT-PCR技术检测了相应细胞因子mRNA水平表达的变化。结果:TCDCA (150μg/mL、180μg/mL、200μg/mL)可剂量依赖性的显著抑制AA模型PMq)细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的含量(P0.05), TCDCA(150μg/mL、180μg/mL)显著提高IL-10蛋白的含量(P0.05)。TCDCA (150μg/mL、180μg/mL、200μg/mL)可剂量依赖性的显著抑制AA模型PMΦ细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6基因的表达量(P0.05),而对IL-10基因的表达量则无显著性的影响(P0.05)。 (5) TCDCA对AA模型大鼠FLS和PMΦ中NF-κB活性表达的影响 通过ELISA法和Western-blot法分别检测了FLS和PMΦ细胞核内NF-κB p65蛋白和细胞内IκBα蛋白的表达量。结果:TCDCA (300μg/mL、400μg/mL500μg/mL)对FLS细胞中活化的NF-κB p65蛋白的表达呈现出剂量依赖性的抑制作用,并显著的提高细胞内IκBα蛋白的表达和抑制磷酸化IκBα蛋白的表达;TCDCA (150μg/mL、180μg/mL、200μg/mL)对PMΦ细胞中活化的NF-κB p65蛋白的表达呈现出剂量依赖性的抑制作用,并显著性提高细胞内IκBα蛋白的表达和TCDCA (200μg/mL)显著抑制磷酸化IκBα蛋白的表达。 总体结论: (1)通过完全弗氏佐剂成功建立了临床症状典型、稳定的AA大鼠模型,建模成功率达到80%以上; (2) TCDCA对AA模型大鼠呈现出良好的治疗作用; (3) TCDCA通过抑制AA模型大鼠FLS和PMΦ中NF-κB的活性,进而降低大鼠血清和滑膜组织中、FLS和PMΦ中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白和mRNA水平的表达,进而发挥其良好的抗关节炎作用。


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