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绵羊-β防御素-1重组原核表达载体的构建及表达

严沁  
【摘要】:β-防御素是抗菌肽分子家族中重要一员,广泛存在于禽类以及哺乳动物多种器官的黏膜上皮组织。作为机体的首道免疫防线,β-防御素生物学活性广泛,能直接杀死病原菌,具有广谱抗菌性、抗病毒、抗细胞毒性及调节免疫等作用,是动物机体抵御病原微生物侵袭的有效天然屏障。当下作为抗生素的替代品,在预防和治疗动物炎症方面炙手可热,有望成为新型抗感染药物。本文主要通过基因工程的方法对绵羊β-防御素成熟肽msBD-1进行构建,并进行原核表达及蛋白纯化。为表达绵羊-β防御素-1成熟肽(msBD-1)蛋白,本研究根据GenBank中公布的msBD-1序列在两端加上酶切位点BamHI和XhoI,进行密码子优化后,借助PCR技术来扩增得到目的片段msBD-1并克隆到载体pGEX-4T-1中,先后由菌液PCR、双酶切以及序列测定,证实目的片段克隆成功。进一步将重组质粒转化到transB(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后,高效融合表达msBD-1蛋白。为增加蛋白的表达量,实验通过改变IPTG的诱导浓度和诱导时间,确定出蛋白表达的最佳诱导条件。同时,经Western Blot分析得出重组蛋白能和GST标签抗体产生特异性反应。结果显示成功表达出msBD-1蛋白,并对msBD-1蛋白进行纯化。


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