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华北地区奶牛乳房炎无乳链球菌的生物学特性及其亚单位疫苗的研究

杜琳  
【摘要】:奶牛乳房炎是奶牛的常见病、多发病,由于其病因复杂多样,病原种类繁多,易反复发作等特点,目前已成为奶牛养殖中造成经济损失最严重的疾病。无乳链球菌是引起奶牛乳房炎最重要的病原菌之一。本研究采用传统细菌学鉴定方法与分子生物学技术相结合,对华北地区2012年至2016年采集的隐形乳房炎乳样中的无乳链球菌进行分离鉴定。并采用纸片扩散法和PCR的方法对这些菌株分别进行耐药谱测定、荚膜分子分型、表面蛋白基因及毒力因子的检测。在无乳链球菌生物学特性的了解的基础上,制备了多糖—蛋白偶联亚单位疫苗,并进行了免疫效果的初步研究。1.本次调查的牧场中的592份乳样中,共分离得到无乳链球菌63株其分离率为10.64%。全部为血清型Ⅰa型,其表面蛋白均为未定型,对无乳链球菌进行7种毒力因子的检测,结果表明7种毒力基因在63株牛源无乳链球菌之间分布无差异。其耐药谱也基本接近。90%-100%的菌株对青霉素G、头孢噻肟、氨苄西林、红霉素、氧氟沙星、克林霉素、万古霉素敏感,82.14%的菌株对四环素耐药。在耐药基因的检测中,首次在牛源无乳链球菌中检测到tetK基因。2.本试验采用在我国华北地区流行的Ⅰa型作为研究对象,从营养条件和培养条件对荚膜形成的影响做了初步的研究,从多个方面研究了无乳链球菌液体培养的影响因素。初步得出了无乳链球菌的最佳培养基组分及最佳培养条件,为大规模工业发酵奠定了基础。3.本试验选取了在无乳链球菌重要的表面抗原Sip.FbsA以及Sip-FbsA串联作为载体蛋白与血清型Ⅰa荚膜多糖偶联,构建亚单位疫苗。Western-blot分析表明,其具有免疫反应性。在此基础上以荚膜多糖CP、Sip蛋白、FbsA蛋白、Sip-FbsA蛋白、蛋白-多糖偶联物CP+Sip-FbsA为疫苗对wistar大鼠进行免疫试验。通过ELISA方法检测免疫大鼠血清的特异性抗体效价,以及T淋巴细胞增殖试验、全血吞噬调理试验、流式细胞术、以及攻毒保护试验评价比较其免疫学特性。结果表明偶联物CP+Sip-FbsA通过首次肌肉免疫,加强免疫经乳房基底部注射,免疫大鼠后,可诱导机体产生较好的体液免疫和细胞免疫反应,机体不仅可产生良好的系统性免疫,还增强了乳腺有效的局部免疫应答,效果在各免疫组中最佳。以上结果说明,我们研制的奶牛乳房炎无乳链球菌亚单位疫苗可以诱导机体产生体液免疫和细胞免疫,该研究成果对华北地区奶牛乳房炎的防治具有参考价值,并为研制预防和治疗性无乳链球菌性奶牛乳房炎的基因工程亚单位疫苗提供了理论基础和试验依据。


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