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硒对奶牛乳腺抗氧化功能的影响及其机理研究

弓剑  
【摘要】:本论文共分5个试验探讨了硒对奶牛乳腺抗氧化功能的影响及其机理。试验1利用体内试验法,采用单因子完全随机试验设计,按照体重、胎次和产奶量相近的原则将21头健康荷斯坦奶牛随机分为3组,每组7头奶牛,在日粮中分别添加0.3(推荐剂量)、0.6和0.9mg/kg的有机硒,以探讨高于推荐剂量的硒添加对奶牛产奶性能、抗氧化及免疫功能的影响。试验2利用体外细胞培养试验,采用单因子完全随机试验设计,研究了不同硒添加水平(0、10、20、50和100nmol/L)对奶牛乳腺上皮细胞(Bovine Mammary Epithelial Cells,BMEC)硒蛋白合成及抗氧化功能的影响,筛选可发挥较好抗氧化功能的硒添加剂量,并从硒蛋白合成、基因转录和蛋白表达水平探讨其影响机理。在试验2的基础上,试验3采用单因子完全随机试验设计,以H2O2为应激源,将BMEC分为对照组、硒处理组、H2O2损伤组和硒预防组,通过研究硒对H2O2诱导的BMEC氧化损伤的保护作用探讨硒对奶牛乳腺抗氧化功能的影响机理。试验4利用硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin Reductase,Trx R)的抑制剂二硝基氯苯(2,4-Nitrochlorobenzene,DNCB)作为诱导源,以细胞存活率、Trx R活性以及抗氧化指标的变化作为判别指标,研究建立了DNCB通过抑制Trx R活性诱导的BMEC氧化损伤模型。在此基础上,试验5采用单因子完全随机试验设计,将BMEC分为对照组、硒处理组、DNCB抑制组和硒预防组,进一步从Trx R-丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)信号通路-花生四烯酸(Arachidonic Acid,ARA)途径探讨了硒对奶牛乳腺抗氧化功能的影响机理。在本试验条件下,得出如下结果:(1)与0.3mg/kg的日粮硒推荐剂量相比,0.6-0.9 mg/kg的硒添加对奶牛的产奶性能无显著影响,但0.6mg/kg的硒添加对抗氧化功能有显著的促进效果,血清谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathion Peroxidase,GPX)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性、总抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity,T-AOC)和硒蛋白P(Selenoprotein P,Sel P)含量显著升高,5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase,5-LOX)活性和活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)含量显著降低;0.9mg/kg的硒添加对抗氧化功能无显著影响。(2)0.6mg/kg的硒添加促进了奶牛的免疫功能,血清白介素2(Interleukin-2,IL-2)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-a)、免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)M和G的含量显著提高。而0.9mg/kg的硒添加与0.6mg/kg相比,免疫功能有减弱的趋势,血清IL-2、TNF-a和Ig M的含量显著降低。(3)在推荐的添加量基础上提高硒的添加水平到0.6mg/kg,可改善奶牛的抗氧化功能与免疫功能,但过高添加不利于抗氧化和免疫功能的发挥。(4)硒对BMEC增殖、GPX和SOD活性、T-AOC和Sel P含量的上调作用以及对ROS和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)浓度的下调作用呈显著的剂量效应,其中,以50-100 nmol/L的硒添加效果较好;硒对Trx R活性的促进效果也呈显著的剂量效应,以20-50nmol/L的促进作用较强;硒蛋白GPX1 m RNA和蛋白的表达量与硒的添加水平呈显著的一元二次升高的剂量依赖关系,以50-100 nmol/L时的上调作用较强。硒也可上调Trx R1和Sel P的m RNA表达量及Trx R1的蛋白表达量,以20-100nmol/L时较强。综合以上指标,50nmol/L的硒添加对BMEC的抗氧化促进效果较好。(5)与对照组相比,H2O2损伤组细胞的增殖率、GPX、Trx R、CAT和SOD活性、T-AOC和Sel P含量、硒蛋白GPX1、Trx R1和Sel P的基因表达及GPX1和Trx R1的蛋白表达显著降低,MDA和ROS含量显著升高,而硒预防组与H2O2损伤组相比上述指标呈相反规律变化。提示硒可保护H2O2诱导的细胞氧化损伤。(6)H2O2诱导的氧化损伤引起细胞p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase,JNK)的磷酸化水平显著增强,胞浆型磷脂酶A2(Cytosolic Phospholipase A2,c PLA2)的活性及其基因表达、ARA的浓度、5-LOX和环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)的活性及其基因表达以及15-过氧羟基二十碳四烯酸(15-Liydroperoxyeicosatetraenoic Acid,15-HPETE)的生成显著提高;而硒预防组与H2O2损伤组相比上述指标均显著降低。提示硒对细胞的抗氧化保护作用可能与Trx R活性增强引起的ARA浓度降低有关。(7)300μmol/L DNCB作用2 h对BMEC产生了明显的氧化应激,细胞增殖率降到73%,Trx R活性降至56%,GPX、SOD和CAT的活性也显著降低,MDA含量显著提高。提示300μmol/L的DNCB作用浓度和2h的作用时间可作为建立细胞氧化损伤模型的适宜剂量与作用时间。(8)与对照组相比,DNCB处理引起细胞增殖显著下降,Trx R活性及其基因与蛋白表达量显著降低,c PLA2活性及其基因表达上调,引起ARA浓度显著升高;硒预防组显著减缓了这些指标的相应变化,使得Trx R活性升高,ARA浓度下降。(9)DNCB处理引起细胞凋亡信号激酶(Apoptosis Signaling Kinase-1,ASK1)活性显著提高,MAPK信号通路中p38MAPK和JNK的磷酸化水平显著增强,细胞c PLA2活性及其m RNA表达、ARA浓度、5-LOX活性及其基因表达以及15-HPETE的生成显著提高;而硒预防组与DNCB抑制组相比上述指标呈相反规律变化。(10)从Trx R-MAPK信号通路-ARA途径诠释了硒对BMEC的抗氧化机理,即硒对细胞氧化损伤的保护作用与Trx R活性的升高引起的MAPK信号通路的抑制、进而导致的ARA浓度降低有关。综合上述研究结果得出,硒可以促进奶牛乳腺的抗氧化功能,其机理是硒可以调节硒蛋白GPX、Trx R和Sel P的合成;硒通过提高Trx R活性抑制MAPK信号通路的活化,引起了ARA及其相关代谢产物浓度的降低,进而预防和保护细胞免受氧化损伤。


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