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奶牛乳房炎三种主要致病菌多重PCR检测方法的建立

李桂宇  
【摘要】:随着人们生活水平提高而急剧增长的牛奶需求量,直接推动了奶牛养殖业的蓬勃发展,但是奶牛乳房炎仍是影响其加快发展的重要原因之一。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和牛支原体是导致奶牛乳房炎发生的主要原因之一。本研究根据金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌16S-23Sr RNA基因和牛支原体OPPD/F基因,设计合成三对特异性引物,通过优化PCR反应体系和反应条件建立三种致病菌的多重PCR检测方法,并验证其敏感性和特异性。分别用传统的细菌分离培养方法和本文所建立的多重PCR方法对13份患临床型乳房炎奶牛乳样和56份正常奶牛乳样进行病原菌检测,比较了两种方法的使用性。试验结果表明,本文所建立的多重PCR方法具有良好的特异性和敏感性。该方法均能扩增出金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和牛支原体特异性条带,扩增条带大小分别为237bp、634bp和333bp,与预计大小相符;而对照菌株均未扩增出任何条带。敏感性试验证明,该方法大肠杆菌最低检测浓度为1pg/μL,牛支原体和金黄色葡萄球菌最低检测浓度均为10 pg/μL。临床样品检测结果表明,本文所建立的多重PCR检测方法优于传统的细菌分离培养检测法;PCR方法累计检出61份阳性乳样,累计检出率为29.5%,其中金黄色葡萄球菌阳性乳样24份,大肠杆菌阳性乳样27份,牛支原体阳性乳样10份;传统的培养方法累计检出40份阳性乳样,检出率为19.3%,其中金黄色葡萄球菌阳性乳样17份,大肠杆菌阳性乳样19份,牛支原体阳性乳样4份。试验结果表明,本文所建立的多重PCR方法具有良好的推广应用价值。


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