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姜黄素对金黄色葡萄球菌性乳腺炎模型小鼠抗炎机制的研究

徐进  
【摘要】:乳房炎是造成奶牛养殖业巨大经济损失的重要常见病之一,同时对人类食品安全形成严重威胁。通过体外和体内试验,从细胞和分子水平系统研究了姜黄素对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)所诱导的乳腺炎模型小鼠的抑菌作用和抗炎作用机制。为我课题组前期研究的以姜黄素为主要有效成分、治疗奶牛乳房炎的蒙兽药复方姜黄乳炎散的临床应用和推广提供数据支持,奠定理论基础。研究分为3个试验,试验1针对姜黄乳炎散、姜黄素和抗生素对致病性S.aureus的抑菌作用研究;试验2选取250只小鼠,随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组(抗生素组)、姜黄乳炎散组和姜黄素组。除空白对照组和模型组灌服灭菌生理盐水外,其余3个组分别灌服0.13 g/kg环丙沙星、1.0 g/kg姜黄乳炎散和腹腔注射0.125 g/kg姜黄素,连续5 d,2次/d。试验结束后,采集样品,用ELISA法进行相关指标的检测,研究了姜黄乳炎散和姜黄素对乳源致病性S.ureus所诱导的乳腺炎模型小鼠的抗炎免疫作用机制;试验3通过分离、鉴定、培养乳腺上皮细胞,研究了姜黄素对TLR2受体介导的MMECs中NF-κB信号通路的影响。研究结果如下:试验1:姜黄素对乳源致病性金黄色葡萄球菌体外抑菌作用研究试验分别用纸片扩散法、肉汤稀释法检测了姜黄素对乳源S..aureus的抑菌作用。结果显示,姜黄乳炎散和姜黄素对S.aureus均有良好的抑菌效果,1 MIC的姜黄素对浓度为1 X 107 cfu/mL的S.aures抑菌作用最为明显(P0.05)。分别采用酶标比浊法、微生物黏附法和试剂盒法,测定姜黄素和姜黄乳炎散对S.aureus生长曲线、菌体表面疏水性、细胞壁及细胞膜渗透性的影响。结果表明,姜黄乳炎散和姜黄素对致病性S.aureus的生长曲线、细胞壁和细胞膜通透性均产生不同程度影响,从而起到抑菌作用。试验2:姜黄素和姜黄乳炎散对金黄色葡萄球菌所诱导的乳腺炎模型小鼠作用机制研究①S.aureus对乳腺炎小鼠乳腺组织形态的影响:乳源S.aureus在建模后可导致小鼠乳腺腺泡减少,结缔组织增生;小叶间导管内可见中性粒细胞浸润。而姜黄素和姜黄乳炎散组小鼠腺泡间淋巴细胞数量增多,中性粒细胞减少,其中,姜黄乳炎散组腺泡内成纤维细胞逐渐增多,结缔组织逐渐形成,较早得以修复。②以模型组Oh为空白对照组,在24~120 h之间,姜黄素、姜黄乳炎散及盐酸环丙沙星组中乳腺炎小鼠模型脏器指数显著高于模型组(P0.05)。③通过流式细胞术、ELISA法和MTT法分别检测淋巴细胞及其亚群、炎性细胞因子及自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)的水平。与模型组相比,姜黄素、姜黄乳炎散及盐酸环丙沙星可显著抑制CD8+、TNF-α、IL-6、IL-1和IL-8的表达(P0.05),增强CD4+、CD3+、CD19+细胞含量和NK细胞活性,使IFN-γ、IL-2和IL-10等细胞因子的释放增加,从而提高抗炎免疫力。试验3:姜黄素对TLR2受体介导的MMECs中NF-κB信号通路研究①通过改良混合酶消化法结合差速贴壁法从小鼠乳腺中分离高纯度的MMECs,经细胞角蛋白8/18鉴定MMECs为阳性。②通过Real-Time PCR和ELISA分析发现,1.0×106 cfu/mL作用24 h时S.aureus引起炎症反应的效果最佳,同时,姜黄素20μg/mL作用12h对S.aureus抑制效果最佳。③通过Real-Time PCR和Western Blot技术对IL-1β、IL-6、TNF-α表达分析发现,姜黄素可通过调节NF-κB信号通路显著降低炎症因子的分泌(P0.05)。结论:姜黄素和姜黄乳炎散可在体外显著抑制S.aureus生长;通过提高乳腺炎模型小鼠免疫脏器指数、增强NK(Natural killer cell)细胞活性和淋巴细胞及其亚群的活性、调控不同细胞因子,以及作用于乳腺上皮细胞的NF-κB信号通路,进而提高小鼠的非特异性免疫功能和抗炎效果。姜黄素对S.aureus的抗菌和抗炎症作用机制的研究将对蒙兽药姜黄乳炎散用于临床治疗奶牛乳房炎提供重要参考依据。


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