绵羊肺腺瘤病毒NM株基因组全序列的研究

【摘要】：绵羊肺腺瘤病毒（jaagsiekte sheep retrovirus ，JSRV）是反转录病毒科β-反转录病毒属(betaretroviruses)的成员之一，是引起绵羊肺腺瘤病（ovine pulmonary adenomatosis,OPA）的主要病原。OPA是一种慢性、进行性、接触传染性的肺脏肿瘤性疾病。广泛分布于除澳大利亚、新西兰和冰岛外，几乎所有养羊业发达的国家和地区，包括我国的新疆、内蒙古等地，严重影响着世界范围内养羊业的发展。同时该病与人的细支气管—肺泡癌（bronchiolo-alveolar carcinoma，BAC）在临床症状、病理组织学特征及超微病变方面极相似，OPA病羊可作为研究人类BAC唯一的理想动物模型。目前，有关OPA的研究已成为人类医学界和兽医学界的热点。但是由于OPA病原的确立经历了一个漫长的过程，而已确定的病原JSRV目前仍未找到适合其繁殖的体外培养体系，因而很难用常规的病毒分离与培养方法来研究该病病原，于是关于该病的病原学研究较滞后。此外目前仍未检测到该病病例外周血中的循环抗体，因而也无法用常规的免疫学方法来诊断该病。于是建立适合JSRV的体外细胞培养体系，搞清该病毒的生物学特性，将是基础理论研究成功的关键，据此建立特异、快速生前诊断该病的方法也是目前急需解决的问题。而对OPA的相关研究在中国一直处于空白状态。 本项研究的主要目标是从我国内蒙古某养羊场采回自然感染OPA的肺肿瘤组织中尝试分离病原、培养病原和克隆JSRV全基因，得到基因组全序列，与国际代表株进行比较分析，研究它们之间的差异率和同源性，寻找遗传变异的规律。同时选择适当的基因制成探针，应用原位杂交技术对病毒进行定位。选择JSRV的env基因尝试性地进行原核表达，为研究该病的发病机理和寻找特异性诊断OPA的方法奠定重要基础。 研究结果显示，以内蒙古某羊场自然感染绵羊肺腺瘤病的病肺组织4例和3月龄健康绵羊胎肺2例作为材料，对胎肺细胞进行原代培养并接种绵羊肺腺瘤病毒悬液，进行JSRV病毒的分离，同时采用电镜负染色技术和超薄切片透射电镜技术对上述样品进行观察和PCR检测，结果表明自然感染绵羊肺腺瘤病的4例病肺组织中都有散在的典型病毒粒子，其直径大小为100-125 nm之间，接种病毒悬液的胎肺细胞从第2代到第9代均出现细胞病变，但对绵羊胎肺培养的病毒悬液电镜负染色观察未发现典型的病毒粒子，而超薄切片透射电镜观察发现了病毒样粒子，设计1对特异性引物进行PCR检测结果为阴性。此试验对建立该病毒的体外培养体系进行了首次探索。 WP=3 参照GeneBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列，设计合成8对引物 ，以病肺肿瘤组织中提取的总DNA为模板，对JSRV中国NM株基因组分8段进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳分析，分别呈8条（531bp,888bp,949 bp, 944bp,1428bp,947bp,1836bp,538bp）特异条带，将其分别回收后克隆入pMD-18 T载体中，分别鉴定阳性质粒进行双向测序并拼接序列，获得完整的绵羊肺腺瘤病毒中国NM株前病毒基因组全序列，基因组全长7430bp，有相互重叠的4个较长的开放阅读框（ORF），分别代表gag、 pro、 pol 和 env基因。序列分析表明，与南非代表株（NC-001494）的核苷酸同源性为90.4%，推导出的氨基酸同源性为90%，与美国代表株（AF105220）的核苷酸同源性为89.1%，推导出的氨基酸同源性为90%。我国NM株与国际代表株亲缘关系相对较远,具有独特的分子结构特征。这是我国首次报道的具有致病性的外源性JSRV基因组全序列。 用地高辛随机引物法标记外源性exJSRV特异的JSRV-2片段，制备探针，原位杂交法检测自然感染OPA的病肺组织中JSRV-NM的 RNA及前病毒DNA，结果表明OPA患羊肺肿瘤细胞的胞浆和核内都有JSRV-2基因mRNA的表达。 根据JSRV-NM基因组全序列，设计1对包含env基因在内的引物，将其克隆于PET-30b表达载体上。序列分析表明env基因编码区为1836bp,编码612个氨基酸残基，构建表达重组质粒env-PET-30b，转化大肠杆菌BL21，经IPTG于37℃诱导培养后，聚丙稀酰胺凝胶电泳分析表明，表达的env融合蛋白分子量约为69KDa。本试验成功表达env融合蛋白为进一步研究OPA的发病机理，建立准确的诊断方法奠定基础。 综上所述，本研究首次获得了我国绵羊肺腺瘤病毒NM株前病毒全基因克隆，确定了前病毒基因组全序列，并与国外代表株的序列进行了比较分析。首次进行了JSRV-NM株的分离培养、病毒定位与env基因的表达。此项研究不仅填补了我国在此方面研究的空白，而且为深入了解JSRV-NM的生物学特性、致病机理等奠定了基础，也对我国开展特异性OPA的诊断有着重要的现实意义。