鸡毒支原体的分离鉴定及基因免疫的研究

【摘要】：鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum， MG)感染也称为鸡败血霉形体感染或慢性呼吸道病(Chronic Respiratory Disease， CRD)。随着养鸡集约化程度的提高，饲养方式的改变以及饲养密度的提高，在通风不良、空气中氨和灰尘增加或气温骤变等环境中极易诱发本病；甚至接种鸡新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎等活疫苗后也都可能诱发本病。鸡感染MG后临床上主要表现为咳嗽、流鼻涕、呼吸时发出啰音，严重时张口呼吸。本病分布于世界各地，可通过水平和垂直方式传播，因此该病在鸡群中可长期存在和蔓延。根据血清学调查，鸡群的感染率平均在50%～80%之间。据统计，鸡毒支原体感染鸡群后，雏鸡的弱雏率增加10%左右，蛋鸡的产蛋率下降10%～20%，肉鸡的体重减少38%，出栏期延长，饲料转化率降低20%，并可间接的引起大量的药费开支，同时造成禽产品中药物残留，所以该病是危害养鸡业的重要疾病之一 。因此，多年来许多国家对该病的防制（治）非常重视，但迄今为止仍未找到理想的防治方法。分子生物学技术的发展为该病的防治提供了新的手段和途径，虽然鸡毒支原体分子生物学研究也取得了一定进展，但对其免疫保护性抗原及其基因的克隆和表达的研究在国内报道很少,对该病进行基因免疫的研究至今未见报道。我区虽有用凝集试验和病理剖解方法诊断有鸡毒支原体病的报道，但迄今尚未见到鸡源支原体的分离、鉴定及分子生物学方面的研究报道，因此，在该病的防治中存在着很大的盲目性。 针对目前我区及国内、外鸡毒支原体病的研究现状和实际需要，我们进行了“鸡毒支原体的分离鉴定及基因免疫的研究”，通过该课题的研究，取得以下结果： 对内蒙古呼和浩特和包头地区四个鸡场的部分鸡用平板凝集试验检查鸡毒支原体的感染情况，结果MG平均阳性率为84.6%，表明MG感染在我区鸡群中广泛存在。 本研究从上述地区四个鸡场的39只鸡中分离到3株支原体，经鉴定两株为鸡毒支原体，分别命名为H3株和BR1株，另一株初步判定为鸡支原体，命名为BR2株。 通过攻毒试验证明，H3株和BR1株均为强毒株。 通过自制油乳剂灭活苗免疫SPF鸡证明，H3株具有较好的免疫原性。 通过PCR扩增，成功克隆了H3株TM-1基因，通过DNA序列测定和比较分析，发现H3株的TM-1基因与S6株的核苷酸差异率为3.435%，氨基酸差异率为4.581%。 通过PET-30a原核表达载体表达证明，TM-1基因可以在大肠杆菌中表达，且表达产物具有免疫反应性。 成功构建了TM-1基因真核表达质粒。 WP=3 通过对SPF鸡的免疫，然后经ELISA和流式细胞术对免疫鸡进行检测，结果表明所构建的真核表达质粒既可诱导机体产生体液免疫，也可以产生细胞免疫。 攻毒试验证明，我们所构建的TM-1基因DNA疫苗的免疫效果与油乳剂灭活苗相当。