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鸡病毒性关节炎病毒分离株S1基因的克隆与序列分析及RT-PCR检测方法的研究

常继涛  
【摘要】: 本试验将鸡病毒性关节炎病毒(AVAV)内蒙古、天津地区分离株(B-98,C-98,G-98,T-98株)经SPF鸡胚增殖活化,进行总RNA的提取。参考GeneBank中ARV-S1133株S1基因序列设计一对测序引物,一对诊断引物。应用测序引物进行RT-PCR特异性地扩增病毒的S1基因。将S1基因cDNA克隆到pGEM-TEasy载体后进行测序。测序结果表明所扩增的cDNA片段长1643个核苷酸,包含了完整的S1基因的三个开放阅读框架(ORF1,ORF2和ORF3)和基因两端的非编码区,ORF1,ORF2和ORF3分别编码P10、P17和σ3蛋白。核苷酸序列比较分析结果表明:4株AVAV分离株之间在P10和P17蛋白基因上均没有核苷酸差异,在σ3蛋白基因上也只存在3个核苷酸差异;4株AVAV分离株与其它参考毒株除ARV-138和纳尔逊海湾病毒(Nelson Bay Virus,NBV)外,同源性都在95%以上。表明,鸡病毒性关节炎病毒我国分离株在S1基因上与参考毒株有很大的相关性。应用诊断引物一步法RT-PCR扩增病毒RNA,以建立RT-PCR诊断方法,同时检测其特异性和敏感性。特异性试验和敏感性试验结果表明,所建立的一步法RT-PCR方法可以检测到经鸡胚增殖的病毒标准株ARV–S11 33及地方分离株(B-98,C-98,G-98,T-98)的核酸,在琼脂糖凝胶电泳中出现了与预期大小一致的435bp的DNA片段,而其他对照病原(NDV,IBDV,IBV,ILTV,EDS76V)的检测结果均为阴性;该RT-PCR的最低检测量为0.5ng的ARV RNA,说明此方法对于禽呼肠孤病毒的检测是特异、敏感的。


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