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JSRV-NM株env基因和CA基因的克隆、表达及其单抗的制备

斯日古楞  
【摘要】: 绵羊肺腺瘤病(sheep pulmonary adenomatosis ,SPA)是由β-反转录病毒属,绵羊肺腺瘤病病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)引起的一种肺肿瘤性疾病,世界动物卫生组织将其列为B类传染病。 为了进一步研究JSRV的致病机制及建立快速诊断SPA的方法,本研究对内蒙古某市种羊场绵羊肺腺瘤病进行流行病理学研究的基础上,从绵羊肺腺瘤病病毒内蒙株(JSRV-NM)自然感染羊的肺肿瘤组织中提取基因组DNA,根据JSRV-NM株基因组全序列,采用Primer Premier 5.0引物设计软件,在env基因的表面蛋白(SU)及跨膜蛋白(TM)基因和gag基因的衣壳蛋白(CA)基因设计引物,经体外重组技术分别进行克隆、构建重组质粒并测序分析变异情况,再分别亚克隆至原核表达载体,在大肠杆杆菌系统中表达蛋白;将CA基因C末端融入HA序列,再亚克隆至真核表达载体上,在真核细胞中进行表达。以原核表达CA蛋白的纯化产物免疫BALB/c小鼠,制备其单克隆抗体(McAb),以原核表达产物与真核表达产物筛选、鉴定制备的McAb。同时,对SPA自然病例和人工感染病例,用所建立的实时荧光定量PCR(real-time Q-PCR)方法检测其外周血白细胞、肺脏、肺门淋巴结及鼻液中JSRV-NM株前病毒拷贝数。实验结果表明:(1)构建的重组质粒pGEM-T-CA、pGEM-T-SU和pGEM-T-TM,分别经测序分析结果显示,CA基因与JSRV-NM株比较氨基酸序列同源性可达99.45%;SU基因所编码的氨基酸共有8处发生突变,同源性为97.36%;TM基因核苷酸序列发生很多突变和终止密码子,与JSRV-NM株序列中该段序列同源性仅为80.2%,这些缺陷型前病毒的大量存在可能与免疫保护存在一定的关系,有待进一步研究;与内源性enJSRV的TM部分序列进行比较结果显示,其氨基酸序列中具有外源性exJSRV特有的致病性“YXXM”序列。(2)重组原核表达质粒pGEX-4T-1-CA和pGEX-4T-1-SU及pGEX-4T-1-TM可以在大肠杆菌中分别以可溶性和包涵体形式高效表达,表达的CA、SU和TM融合蛋白表观分子量分别约为37KDa、68KDa和46KDa,表达量分别占全菌蛋白的20%、25%和30%,并利用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析柱纯化可溶性表达蛋白和从包涵体分离纯化得到的表达蛋白具有较高纯度,是一种理想的免疫原。(3)构建的重组真核表达载体pCDNA3.1(+)-CA-HA,转染至293细胞和Hela细胞后,用Anti-HA单抗经间接免疫荧光和Westhern blotting法检测蛋白表达。结果显示该载体转染293细胞后,可在细胞内观察到特异性荧光和检测到目的基因的表达产物。说明已成功地构建了CA蛋白的真核表达载体,并可在真核细胞内表达CA目的基因。(4)用原核表达CA蛋白的纯化产物免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,获得3株能稳定分泌抗体的单克隆细胞。利用CA真核表达蛋白分别对此3株杂交瘤细胞经间接免疫荧光方法鉴定,结果证实所获得的3株杂交瘤细胞分泌的抗体均为针对JSRV-NM株CA蛋白的特异性McAb。(5)根据JSRV-NM株env基因序列,选取其保守序列作为检测的目的片段,设计并合成相应的引物和TaqMan探针,以SPA自然病例的肺肿瘤组织基因组DNA为模板,用PCR方法构建重组质粒pGEM-T-Env,并严格定量后,梯度稀释作为阳性标准品,优化反应条件后进行real-time Q-PCR扩增,获得相应的标准曲线为:Y=-3.308X+47.848,线性相关系数为0.991;经同一标本重复检测,Ct值变异系数小,并且灵敏度比常规PCR高10-100倍。因此初步建立了检测JSRV前病毒DNA的real-time Q-PCR技术平台。(6)应用初步建立的real-time Q-PCR方法对不同来源的绵羊外周血样品及其他组织样品进行初步地检测,测定其前病毒载量。结果显示B组和C组外周血白细胞、肺脏、肺门淋巴结以及鼻液中检测前病毒DNA均为阳性,并发现前病毒DNA的载量在肺脏中明显高于外周血白细胞,高达10~1000个拷贝;D组虽未发现有SPA临床症状,但在肺门淋巴结里可以检测到前病毒DNA;E组中一只绵羊的肺脏也检出低拷贝数的前病毒DNA,而在A组中检测结果均为阴性。 本项研究是国内首次对JSRV进行相关蛋白的分子克隆与表达研究、单克隆抗体的制备以及real-time Q-PCR检测,对SPA分子发病机理进一步研究及建立更为灵敏的检测JSRV的特异性方法以及研究SPA防制措施等均有重要意义。对保障我国种羊业的战略安全以及对养羊业的健康发展,具有重要的学术意义和实用价值。


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