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蜡样芽孢杆菌工程菌的构建及α-淀粉酶基因的表达

张琳琳  
【摘要】: 蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是产生具有重要价值的耐高温α-淀粉酶(α-amylase)的优良菌株。通过对两株蜡样芽孢杆菌(B.cereus905和B.cereus904)分泌的α-淀粉酶酶学性质分析,淀粉酶的最适反应温度为90~100℃,最佳pH范围为6.0~10.0,耐热性和酶活都不依赖Ca2+,酶学性质基本一致,但淀粉酶的分子量有明显的不同。PCR方法分别克隆了B.cereus905和B.cereus904耐高温α-淀粉酶的基因全长(amy905和amy904),并在大肠杆菌中诱导表达,结果显示:amy905基因长度为1761bp,其蛋白分子量约为68 KD;amy904基因长度为1362bp,其蛋白分子量约为55 KD。 大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pHP14-promp,内含一段来自B.cereus905基因组的启动子序列,将amy904基因插入该载体,获得了蜡样芽孢杆菌淀粉酶表达载体pHP14-amy904,用其转化蜡样芽孢杆菌B.cereus905,并成功在B.cereus905中表达。工程菌株遗传稳定性实验表明菌中质粒pHP14-amy904的稳定性为94%,生长曲线测定显示,野生菌株与工程菌株生长情况基本相同。 本试验构建的工程菌,验证了载体pHP14-promp中来自B.cereus905基因组的启动子能在蜡样芽孢杆菌体内有效启动外源基因,并进行转录与表达。这一研究结果不仅为今后深入研究蜡样芽孢杆菌在定殖时外泌蛋白淀粉酶的作用机理打下了良好的基础,也为今后这些菌株进一步改造为更高效的抗病虫基因工程菌提供了一条可借鉴的思路。


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