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异源强毒株HN基因替换对嵌合体新城疫rLaSota病毒致病力影响的研究

丁玉林  
【摘要】: 新城疫(Newcastle disease,ND)是危害世界养禽业的重大烈性传染病。由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起,NDV为单股负链RNA病毒,属于副黏病毒科( Paramyxoviridae)、禽副黏病毒属(Avulavirus)。NDV基因组全长15kb,其基因组编码的蛋白包括核蛋白(nucleoprotein.NP),磷蛋白(phosphoprotein,P),基质蛋白(matrix protein,M),融合蛋白(fusion proteins,F),血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin- neuraminidase,HN)和大聚合酶蛋白(RNA-dependent RNA polymerase or large polymerase,L)六个独立转录编码单元。 人们对新城疫病毒致病性的研究主要集中在F蛋白和HN蛋白的致病力上,认为F蛋白的裂解位点的氨基酸序列是新城疫病毒致病性的主要决定因素。NDV的HN蛋白是一个多功能蛋白,NDV的HN基因在病毒的感染过程中扮演着重要角色,但是HN基因对致病性的确切作用还不十分明确。HN蛋白具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种活性。识别细胞表面的唾液酸的受体并促进F蛋白的融合作用。因此,HN蛋白在病毒的感染过程中扮演着重要的角色。 本研究在成功重组新城疫Lasota的基础上,利用反向遗传操作技术,将强毒株F48E9、HB38的HN基因替换rLasota的HN基因。提取F48E9、HB38基因组RNA,利用引物经RT-PCR获得其HN基因的PCR产物。连接pBluscriptⅡKS(+/-)载体多克隆位点上,测序正确后,利用特定的MunⅠ和SpeⅠ酶切位点酶切得HN基因片段。构建全长质粒,进行转染,收获病毒rL-F48E9HN、rL-HB38HN。拯救病毒rL-F48E9HN、rL-HB38HN的F3代,收获病毒阳性尿囊液提取病毒基因组RNA,进行RT-PCR及序列分析。 嵌合病毒rL-F48E9HN、rL-HB38HN在鸡胚内的生长特性与亲本株Lasota一致,与F48E9、HB38的生长特性相差甚远。通过分析是否HN蛋白的来源对于NDV的生物学活性有一定的影响,以及亲本毒株及嵌合病毒红细胞吸附性和融合作用。结果表明:嵌合病毒红细胞吸附性明显增强,rL-F48E9HN、rL-HB38HN分别增加51%、62%,而融合作用无明显变化。嵌合病毒对鸡及鸡胚的致病性研究表明:rL-F48E9HN、rL-HB38HN的MDT分别为148h、120h,ICPI分别为0.43、0.64;IVPI均为0。说明嵌合病毒rL- F48E9HN、rL- HB38HN的致病指标有微弱的增强,但是并没有达到强毒力水平,仍属于弱毒株。结果也表明NDV的致病性是多基因作用的结果,F蛋白的裂解位点并不是NDV毒力的唯一决定因素。


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