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牛羊混合胆汁中有效成分的提取纯化及GCA在大鼠体内的药动学研究

李少春  
【摘要】: 本文在实验室提取纯化牛羊混合胆汁中有效成分工艺的基础上,通过改进和完善工艺、扩大试验规模,建立了一套稳定、可靠的从牛羊混合胆汁中提取分离天然牛磺酸、胆酸、甘氨胆酸及牛磺胆酸的小试工艺技术路线,并对提取过程中废弃的的原料及试剂进行了回收套用研究,同时开展了有效成分甘氨胆酸在大鼠体内的药代动力学研究。旨在为下一步开展从牛羊混合胆汁中提取有效成分的中试实验研究奠定试验基础,为牛羊胆汁的综合开发利用提供可靠的理论依据和可能性,同时为阐明甘氨胆酸在大鼠血清及组织中的分布和变化规律,开发脏器生化药物新资源提供线索。 提取牛磺酸的小试工艺研究采用脱蛋白、除色素、碱解酸化等方法开展了从牛羊混合胆汁中提取天然牛磺酸的小试工艺研究。采用纸层析法和红外光谱扫描法对提取物进行定性检测,试验结果证明提取样品与牛磺酸标准品显色斑点Rf值相同,红外光谱特征吸收峰一致,表明提取出的样品为牛磺酸;采用薄层扫描法测定其含量,结果证明其纯度平均达98.6%;测定了方法回收率,结果表明牛磺酸提取量平均达13.1g/L,回收率平均达86.7﹪,这与实验室工艺提取牛磺酸的结果一致,表明该提取工艺稳定、可靠。 提取胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸的小试工艺研究采用脱蛋白、除色素、萃取、柱层析分离等方法开展了从牛羊混合胆汁中分离、提取和纯化胆酸、甘氨胆酸及牛磺胆酸三种有效成分的小试提取工艺研究。采用正交试验筛选了柱层析最佳条件,以容积为10L的层析柱进行分离纯化,固定相为硅胶,流动相为氯仿和正丁醇混合溶剂,一次装样量3000mL胆汁,流动相采用梯度洗脱,先按4:1比例分离胆酸和甘氨胆酸,然后按3:2比例分离甘氨胆酸和牛磺胆酸,流动相洗脱速度为3~5mL/s。采用薄层层析法和红外光谱扫描法对提取物进行定性检测,结果证明三种提取样品分别与胆酸、甘氨胆酸及牛磺胆酸标准品显色斑点Rf值相同,红外光谱特征吸收峰均一致,表明提取出的三种样品分别为胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸结晶体。采用薄层扫描法测定其含量,结果证明三种成分平均纯度分别达98.0%、98.4%、98.6%。首次测定了方法回收率,结果显示三种成分提取量平均分别达11.0g/L、9.1g/L、9.3g/L,回收率平均达64.4﹪、63.7﹪、67.8﹪,这与实验室工艺提取三种有效成分结果一致,表明小试提取工艺稳定、可行。采用留样观察法研究了不同批次的三种有效成分在室温环境和4℃封闭避光环境下的稳定性,结果表明,三种白色粉末样品在室温环境中均不稳定,易受潮变质,在4℃封闭避光环境下均具有较高的稳定性,不易变质。 废旧原料、试剂的回收套用研究采用精馏法回收了提取工艺中的废旧乙醇,试验结果表明回收乙醇纯度平均达95%以上,符合提取工艺纯度要求;采用碱洗、酸洗及去离子水洗涤等方法对废旧硅胶进行了回收,结果表明回收硅胶物理性状与新硅胶无差异,pH值相同;将回收乙醇和硅胶重新套用到提取工艺中,结果证明提取效果与新乙醇、硅胶提取效果无显著差异,表明使用回收乙醇和硅胶不影响对四种有效成分的提取效果,可以重复利用。 甘氨胆酸在大鼠体内的药代动力学研究采用固相萃取-反相高效液相色谱法测定了大鼠血清及肝、肾、脑组织中甘氨胆酸的含量。结果表明,在0.15625~10.0μg/ml范围内血清中甘氨胆酸浓度与峰面积呈良好的线性关系,回归方程Y= 39579X + 57823,R2=0.9984;以信噪比S/N=3为标准,最低检测浓度为0.02μg/ml;平均回收率为98.49%;日内RSD为0.52%~2.00%,日间RSD为0.74%~4.98%;稳定性试验第一组的平均含量为99.35%,RSD为2.24%,第二组的平均含量为100.87%,RSD为4.73%;测定了肝、肾、脑组织中甘氨胆酸含量,采用体外甘氨胆酸标准品制备标准曲线的方法计算了相应的组织浓度,其结果仅反映组织中甘氨胆酸浓度的相对变化规律,不能体现真正的组织浓度值,但对组织样品的稳定性进行了较细致的考察,其结果和血样结果基本一致。该方法具有简便、稳定、准确、实用的特点,适用于甘氨胆酸含量的分析。 采用固相萃取-反相高效液相色谱法测定了给药后不同时间血清及肝、肾、脑组织中甘氨胆酸的浓度。结果显示:⑴在血清中符合一级吸收二室模型,药动学方程:C= 41.17e-1.256t+84.7 e-0.491t-125.87e-0.667t。⑵在肝脏中符合一级吸收一室模型,药动学方程:C= 18.734(e-0.042t-e-0.733t)。⑶在肾脏中符合一级吸收一室模型,药动学方程:C= 105.88(e-0.076t-e-0.081t)。⑷在脑组织中符合一级吸收一室模型,药动学方程:C= 5.312(e-0.082t-e-0.098t)。结果表明,甘氨胆酸口服给药后,在大鼠体内吸收快、分布广、消除较缓慢,在体内能保持较长时间的药物浓度,有利于其临床药理作用的发挥。


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