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JSRV检测及JSRV转录起始调节基因LTR致瘤机制相关性研究

罗军荣  
【摘要】: 绵羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenomatosis,OPA)是一种绵羊肺腺瘤病病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)导致的肺腺泡样肿瘤性疾病,病原JSRV为β-反转录病毒,国际兽疫局(OIE)将该病列为B类传染病。在国内,该病目前主要依靠常规病理学方法检测诊断,严重障碍了我国OPA的快速诊断和防控,同时,对绵羊肺腺瘤病的发病机理尚有很多不清楚的地方。 为了进一步研究JSRV的致病机制及建立快速诊断OPA的方法,本研究在绵羊肺腺瘤病流行病学﹑病理学研究的基础上,以获得的3株抗JSRV-CA蛋白的单克隆细胞分泌的McAb为一抗,应用Western blot进行肽探针扫描,以鉴定三株单抗识别的线性表位;并应用非竞争性ELISA法测定三株单抗的功能性亲和常数,筛选合适的单抗,用于建立基于JSRV-CA的血清学诊断法。 以阳性标准病料与健康阴性羊肺组织为样本,比较阴性﹑阳性样本对JSRV-CA重组蛋白与抗JSRV-CA单抗的阻断率的差异,首次在国内建立了绵羊肺腺瘤病的阻断ELISA方法,并对该方法的特异性及临床应用作了检测。同时,应用生物学软件ClustalW(1.8)对内源性JSRV(enJSRV)与外源性JSRV(exJSRV)进行序列对比,针对两者差异显著的LTRU3区设计了特异性引物,在国内首次建立了特异性PCR及套式PCR检测exJSRV的方法。在700ng健康羊基因组DNA的背景下,梯度稀释阳性质粒pJSRV LTR为参照,对两种PCR方法的敏感性进行比较,并以建立的方法对临床病料进行检测。 为研究JSRV转录起始/调节基因(LTR)与病毒致瘤机制的相关性,需高纯度、高活力的肺泡Ⅱ型上皮细胞及enJSRV/exJSRV LTR作为研究材料。本研究采用IgG黏附法结合磁化树脂微粒法分离并纯化了山羊肺泡Ⅱ型上皮细胞,并应用碱性磷酸酶(AKP)结合核固红染色鉴定细胞的纯度,应用台盼蓝检测细胞的活力。此外,克隆了JSRV的内外源性LTR,并对其结构进行了分析。用生物学软件DNAstar﹑MatInspector比较了LTR U3区的同源性及细胞转录因子结合位点的差异,并基于U3区的核苷酸序列,用生物学软件Mega绘制了JSRV LTR系统遗传进化树。在获得了肺泡Ⅱ型上皮细胞及enJSRV/exJSRV LTR的基础上,应用双萤光素酶报告基因技术,比较了绵羊﹑山羊enJSRV LTR与绵羊exJSRV LTR在不同细胞内的启动子活性。此外,分别缺失突变了LTR的Gfi-Ⅰ﹑C/EBP﹑HNF-3β等三个转录因子结合位点,比较了绵羊exJSRV LTR与突变后exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内启动子活性的差异。 实验结果为:⑴本研究建立的ELISA法以阻断率为37%作为阴性与阳性判断的临界点,可以明确区分感染JSRV的阳性病料与健康阴性对照。所建立的PCR检测方法中,套式法的敏感性是一步法的10倍以上,可检测出样本中1~10拷贝的JSRV,同步检测结果表明,以上的血清学和PCR检测方法与临床病理组织学诊断的结果高度一致。⑵本研究分离纯化的肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度为90%以上(AKP染色法),活细胞为95%以上(台盼蓝染色法)。⑶将本研究克隆测序的enJSRV/exJSRV LTR与GenBank上发表的其它JSRV LTR序列进行了系统遗传进化树分析,表明本研究克隆的enJSRV/exJSRV LTR分支明显,且现有的enJSRV/exJSRV LTR在病毒与宿主共进化的过程中分别演化出2个不同的分支。本研究克隆的我国内蒙古地区JSRV流行株与欧美毒株有较近的亲缘关系。⑷双荧光素酶分析试验表明,除肺泡Ⅱ型上皮细胞外,enJSRV/exJSRV LTR在各细胞内的启动子活性差异较小,而exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内相对活性为其他细胞内相对活性的24-230倍。分别缺失突变C/EBP﹑HNF-3β转录因子结合位点的绵羊exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内的启动子活性下降约60%-70%。 以上结果表明:JSRV病毒粒子及exJSRV序列在肺肿瘤组织中含量高,是临床实验室检测的理想材料,而外周血白细胞中亦含有exJSRV序列,需用高敏感的套式PCR作检测。exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内表现出高活性,说明绵羊exJSRV LTR对肺泡Ⅱ型上皮细胞具有特殊嗜性。此外,缺失转录因子C/EBP﹑HNF-3β结合位点显著影响绵羊exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内的启动子活性,说明这两个转录因子结合位点对绵羊exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内的特殊嗜性具有重要作用。 本研究建立的特异性实验室检测JSRV方法,对于我国养羊业的健康发展,具有重要的理论价值和实用价值。另外,JSRV LTR致瘤相关性研究对于丰富JSRV的分子发病机理以及研究OPA防制措施等均有重要意义。


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