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沙冬青脱水素基因的克隆及对烟草的遗传转化

乔慧蕾  
【摘要】: 本论文成功克隆了耐旱植物沙冬青中的脱水素基因,构建了植物表达载体并通过农杆菌介导法将其导入烟草中,获得了PCR检测阳性的转基因植株,为研究脱水素基因在转基因植物中的表达奠定基础。主要研究内容与结果如下: 1、根据沙冬青脱水素基因cDNA序列设计特异引物,以沙冬青基因组DNA为模板进行特异性扩增,成功克隆了该脱水素基因。该基因全长1106bp,没有内含子,开放阅读框长552bp,5’UTR 98bp, 3’UTR 456bp,编码一条183个氨基酸的多肽。 2、利用含有BstEⅡ和BglⅡ限制性内切酶位点的特异引物从重组的克隆载体中PCR获得目的片段,并将其定向插入到植物表达载体pCAMBIA3301的GUS表达区,获得重组表达载体pCAMBIA3301-DHN,通过冻融法将此表达载体导入农杆菌LBA4404中,提取转化质粒,经PCR鉴定表明脱水素基因植物表达载体构建成功。 3、以烟草无菌苗叶片为转化受体材料,用携带脱水素基因的表达载体的根癌农杆菌进行叶盘转化,获得Kan抗性植株。提取转化植株总DNA,以重组表达载体为阳性对照,以非转基因植株为阴性对照,对转化植株进行PCR扩增,证明脱水素基因转到了烟草中。


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