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向日葵染色体核型分析及单染色体微切割、微分离和微克隆

闫素丽  
【摘要】: 向日葵是重要的油料作物,对其染色体进行核型分析,微切割、微分离单染色体并建立单染色体文库,可以为向日葵高密度遗传图谱的构建及重要基因的分离等奠定基础。本研究以内葵杂3号三交种和单交种为材料,摸索了向日葵染色体制片技术并进行了核型分析,微分离了随体染色体,建立了完整的单条染色体DNA文库,主要研究内容及结果如下: 1.用0.05%秋水仙素、0.002mol.L-18-羟基喹啉及4℃低温对向日葵根尖进行预处理,结果以0.05%秋水仙素和0.002mol.L-18-羟基喹啉处理效果较好,可以得到染色体分散好,着丝点清晰的标本片。 2.核型分析结果表明:内葵杂3号三交种和单交种的染色体数均为2n=34,且各有一对随体染色体。三交种第2对和第10对染色体为近中部着丝粒染色体,其余为中部着丝粒染色体,第2对具有随体,染色体相对长度变异范围4.092%-7.729%,核型公式为2n=2x=34=30m+4sm(2sat);单交种全部为中部着丝粒染色体,第4对染色体具随体,染色体相对长度变异范围3.661%-8.128 %,其核型公式为:2n=2X=34=34m(2sat)。 3.在国内外首次进行了向日葵的单染色体分离。本文采用玻璃针法显微分离了内葵杂3号三交种和单交种的随体染色体,经两轮LA-PCR扩增得到250-1500bp的DNA片段;Southern杂交表明,扩增片段与向日葵基因组DNA之间有同源性,证明向日葵随体染色体DNA已经被成功扩增。 4.将三交种和单交种随体染色体扩增片段克隆到pGEM?T?Easy上,建立了各自的单染色体文库。三交种获得2.26×105个克隆,PCR检测、酶切鉴定确定片段在200-700bp之间,平均插入片段大小为535bp;单交种获得2.57×105个克隆,PCR检测、酶切鉴定确定片段在200-500bp之间,平均插入片段大小为480bp。


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