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奶牛X-,Y-精子抑制消减文库的构建

柳强  
【摘要】: 对新生家畜性别的控制一直都备受养殖业关注,在多种性别控制的手段中性别控制精液的分离被认为是比较便捷且成本比较低的方法。本文针对H-Y抗原抗体分离法的机理对X-、Y-精子在转录组水平的差异进行研究,以期找到两类精子间存在的有意义的差异。 RNA作为遗传信息传递的中间载体,在精子发生、精子存活、精卵结合过程中都起着重要的作用。本研究针对精子结构和RNA含量特点,对奶牛精子RNA提取进行了摸索,创造性的用植物组织RNA提取的方法对哺乳动物精子进行处理提取RNA。通过对持家基因GAPDH的PCR扩增检测,证明了所制备的RNA有较好的完整性;同时针对精子较低的RNA含量,采用SMART技术对所提取的X-精子、Y-精子转录本进行了等比例扩增,并采用限制性内切酶RsaⅠ对扩增后的cDNA进行了酶切,酶切后的cDNA分成两部分连接上不同的接头,同未连接接头的driver进行连续两轮的杂交。通过两轮PCR扩增后将扩增子连接上pGEMTeasy载体并转化到感受态大肠杆菌体内。将正库得到的366个克隆,反库得到的292个克隆序列去载后,通过BLAST进行数据比对,发现大多数的序列都没有找到同源基因。这可能由于牛的EST还很不完善所致,这样可以通过对一些新的EST进行研究,从而不断充实数据库,并且找到一些能为差异蛋白的研究需要的试验依据和理论基础。


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