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紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的遗传转化

靳苗苗  
【摘要】: 柠檬酸合成酶是调节植物体内有机酸的活性酶之一,也是参与草酰乙酸和乙酰辅酶A缩合生成柠檬酸的一个关键酶。增加植物体内的柠檬酸可以提高植物对土壤中磷的吸收以及抗铝毒性。紫花苜蓿是优良的豆科牧草,目前全世界种植面积达3000多万hm2,我国属世界上栽培利用苜蓿较多的国家之一。全国共有14个省区种植苜蓿,产区以华北、西北为主,但苜蓿在南方种植相当有限,有人认为苜蓿在南方种植受到抑制的主要因素是酸性土壤中的Al~(3+)。通过利用遗传转化的手段将柠檬酸合成酶基因转化到不耐铝的植株中,提高植物的耐铝性,这样可以更好的从根本上解决Al~(3+)对植物的毒害。 基因的克隆首先从紫花苜蓿中总RNA逆转录的cDNA中扩增出cs基因的保守序列,再利用RACE技术,获得MsCS基因cDNA全序列。该基因cDNA全序列共2031bp,其中5’端非编码区39bp,3’端非编码区434bp,其包含一个完整的开放阅读框包含1551bp,编码517个氨基酸残基,所编码的蛋白质分子量为56.743KDa。根据相关植物柠檬酸合成酶基因的氨基酸序列,利用DNAMAN对该基因推导的氨基酸序列与大豆、拟南芥、水稻、高粱的柠檬酸合成酶基因推导的氨基酸序列进行多重序列比对分析,结果表明,该基因与大豆,拟南芥,水稻和高粱具有高度的同源性,同源性都达到90%以上。 植物的表达载体的构建以及对烟草的遗传转化是首先利用pBI121载体,成功的构建MsCS基因的植物表达载体pBI-MsCS;然后运用农杆菌介导法以及叶盘法转化烟草,期望得到MsCS基因超量表达的转基因植物。经抗生素筛选,得到17株转化的再生苗。提取再生植株的叶中DNA,进行PCR检测,结果均呈阳性,初步证实所得6个阳性再生植株。


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