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AM真菌调控黄花铁线莲生长和有效成分含量的机制研究

刘婷  
【摘要】:丛枝菌根真菌,即AM真菌(Arbuscular Mycorrhiza Fungi,AMF),是一类广泛分布于土壤生态系统的有益微生物,可与90%的高等植物形成AM共生体,菌根。AM真菌能促进植物对营养元素和水分吸收,改善植物的营养状况,从而促进植物的生长发育,提高植物次生代谢产物的积累和抗逆性。黄花铁线莲(Clematis intricata Bunge)为毛茛科铁线莲属草本植物。在中药、蒙药、藏药中作为一种重要的药用植物而被利用,其主要活性成分为黄酮类,有抗炎、镇痛和抗肿瘤活性,且毒性很小。本课题采用湿筛倾析法,研究内蒙古7个地区黄花铁线莲根际土壤AM真菌多样性;在盆栽条件下研究了不同氮(N)、磷(P)水平下接种摩西球囊霉(Glomus mosseae)对黄花铁线莲生长、生理生化特性和总黄酮积累以及利用qRT-PCR技术分析黄酮类生物合成途径关键酶基因响应不同N、P水平,探讨AM真菌对黄花铁线莲生长和有效成分含量积累的影响机制;利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术克隆黄花铁线莲黄酮类生物合成途径的两个关键酶基因,苯丙氨酸解氨酶基因(CiPAL)和查尔酮合成酶基因(CiCHS),并对其进行生物信息学分析。本课题为规模化种植中蒙药材提供了菌根学和分子生物学依据。主要研究结果如下:1.从内蒙古7个地区的黄花铁线莲根际土壤中,共分离出3属29种AM真菌,其中球囊霉属Glomus 27种,盾巨孢囊霉属Scutellospore 1种,无梗囊霉属Acaulospora 1种。结果表明,黄花铁线莲根际土壤中AM真菌多样性丰富。2.盆栽条件下,不同N水平下接种AM真菌对黄花铁线莲生长有显著影响。不同N水平下,AM真菌均能侵染黄花铁线莲根系,并且能够有效促进黄花铁线莲的生长,提高产量;适N条件下,AM真菌通过影响过氧化物酶活性和渗透调节物质脯氨酸含量,促进黄花铁线莲生长;通过调控黄酮生物合成途径的相关酶基因的表达(其中CiCHS的表达量显著上调)而促进地上部分总黄酮的积累,能够有效改善黄花铁线莲的药材品质。高N则限制了黄花铁线莲生长,降低有效成分含量。因此,施N量为10%N~20%N时,接种AM真菌效果最好。3.盆栽条件下,不同P水平下接种AM真菌对黄花铁线莲生长有显著影响。不同P水平下AM真菌均能侵染黄花铁线莲根系,并且能够有效促进黄花铁线莲生长,提高黄花铁线莲产量;适P水平下,接种AM真菌通过影响过氧化物酶活性和渗透调节物质脯氨酸含量,降低叶片丙二醛含量,使黄花铁线莲更好地生长;通过调控黄花铁线莲黄酮生物合成途径关键酶基因的表达(其中CiPAL和CiCHS的表达量显著上调),促进地上部总黄酮积累,改善了黄花铁线莲药用品质。综合考虑,施P量为5%P~20%P时,接种AM真菌效果最好。4.利用RACE技术,克隆得到CiPAL和CiCHS两个基因的cDNA全长序列。其中,CiPAL cDNA序列全长为2386 bp,含有1个2118 bp的完整ORF,编码705个氨基酸。在CiPAL的第187-202位,含有一个酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIA),是典型的PAL家族成员;CiCHS cDNA序列全长为1445 bp,含有1个1191bp的完整ORF,编码396个氨基酸。CiCHS含有CHS-like和CHS酶家族两个保守功能域,是典型的CHS家族成员。5.本研究发现,在适量的N、P水平下,AM真菌能够有效促进黄花铁线莲生长,诱导黄酮类生物合成关键酶基因的表达,提高黄花铁线莲有效成分含量,改善其药用品质。


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