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蒙药肋柱花指纹图谱及显微组织化学研究

孙兴姣  
【摘要】:蒙药肋柱花为龙胆科肋柱花属肋柱花(Lomatogonium rotatum(L.)Fries ex Nym.)的干燥全草,主要活性成分含有环烯醚萜类、黄酮类、皂苷类等,是蒙医常用药材。近年来,肋柱花的混伪品、代替品较多流入临床,影响临床疗效和用药安全。目的:建立蒙药肋柱花HPLC指纹图谱、含量测定方法及显微组织化学方法,为肋柱花的药材的鉴别、质量控制提供依据。方法:(1)采用HPLC法对内蒙古不同采集地的15批肋柱花样品进行指纹图谱研究。(2)并在此色谱条件下同时测定全草及不同药用部位4种活性成分的含量。(3)采用紫外分光光度法,以獐牙菜苦苷为对照品,测定15批次蒙药肋柱花总环烯醚萜苷的含量。(4)应用显微组织化学方法对肋柱花活性成分进行组织定位。结果:(1)建立蒙药肋柱花HPLC指纹图谱及全草和不同药用部位HPLC特征图谱,最佳色谱条件:YMC C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.4%磷酸水(B)-甲醇(C),梯度洗脱,乙腈始终为10%,0~10min,90%~85%B;10~20min,85%~80%B;20~24min,80%~78%B;24~27min,78%~75%B;27~37min,75%~72%B;37~40min,72%~70%B;40~45min,70%~65%B;45~47min,65%_~60%B;47~48min,60%~58%B;48~65min,58%~50%B;65~77min,50%~50%B。流速为0.8mL·min-1,柱温30℃,进样量10μL,检测波长254nm。确定了15个共有峰,指认了5个共有峰分别为獐牙菜苦苷、异荭草苷、当药黄素、芹菜素、木犀草素,15批次肋柱花药材与生成对照指纹图谱的相似度在0.881~0.997范围内。(2)采用上述蒙药肋柱花HPLC指纹图谱的色谱条件同时测定全草和不同药用部位獐牙菜苦苷、异荭草苷、当药黄素、木犀草素4种成分的含量。獐牙菜苦苷、异荭草苷、当药黄素、木犀草素分别在0.08~0.48ug(r=0.9998)、0.02~0.15ug(r=0.9999)、0.02~0.12ug(r=0.9999)、0.03~0.12ug(r=0.9998)范围内呈良好线性关系。(3)采用紫外分光光度法测定内蒙古不同产地15批次肋柱花总环烯醚萜苷类成分的含量,獐牙菜苦苷的回归方程为Y=3.4214X-0.0068,R~2=0.9995在0.04~0.14mg·ml~(-1)范围内吸光度值与浓度有良好的线性关系。(4)应用组织化学定位技术来确定:经1%醋酸镁甲醇染色后,茎表皮细胞外壁及角质层、茎木质部及叶的上、下表皮细胞壁和叶脉木质部在荧光显微镜下呈现荧光绿,说明茎中黄酮类化合物储存部位为角质层、表皮细胞外壁、木质部;叶中黄酮类化合物主要储存在叶的上、下表皮细胞壁、叶脉木质部以及栅栏组织和海绵组织细胞中。浓盐酸-苯胺-高氯酸染色后,茎木质部细胞呈黄色至棕色,说明肋柱花茎中环烯醚萜类主要储存部位为茎木质部。结论:(1)首次建立蒙药肋柱花药材指纹图谱及4种活性成分的含量测定方法重复性好、精密度高和稳定性良好,同时实现定性和定量测定,可作为该药材的质量控制方法;(2)不同部位的含量测定为肋柱花临床药用部位的选择和显微组织化学定位研究提供依据;(3)建立的蒙药肋柱花总环烯醚萜苷含量测定方法简单、快捷并结合HPLC含量测定方法,可作为该药材质量评价的依据;(4)建立蒙药肋柱花显微组织化学定位研究方法,定位准确、显色明显,明确茎、叶中活性成分的具体储存组织,为日后活性成分累积及其动态转移和生物合成途径研究奠定基础。


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