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甜瓜CmNAC56基因在果实成熟过程中的功能分析

吴晗  
【摘要】:甜瓜(Cucumis Melo)隶属于葫芦科,是双子叶二倍体,一年匍匐蔓生植物。甜瓜在我国种植历史悠久,种植面积大,其果实有较多营养物质和微量元素,深受人们喜爱,近年来甜瓜果实在研究肉质果实成熟机制方面作用突出贡献。本研究以品质性状优良的河套蜜瓜(Cucumis melo L.cy Hetao)为实验材料,对果实发育转录组数据中存在差异表达的CmNAC56基因在果实成熟过程中的功能进行研究。主要研究结果如下:(1)生物信息学分析甜瓜CmNAC56基因的结果,共编码353个氨基酸,CmNAC56基因位于甜瓜6号染色体上。CmNAC56基因编码的蛋白质分子总量为39371.84 Da,理论等电点是8.32,为稳定的疏水蛋白,CmNAC56蛋白无前导肽,无信号肽,没有跨膜结构域,二级结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲三种结构组成为mixed型,互作蛋白预测显示CmNAC56蛋白与AP2-like ethylene-responsive transcription factor TOE3蛋白等7个蛋白直接作用。(2)甜瓜基因组数据库中甜瓜CmNAC56基因的c DNA长度为1678bp,其中内含子和外显子各3个,设计引物克隆到CmNAC56基因的开放阅读框序列为1062 bp。成功构建过表达载体p PZP221(35S-CmNAC56-NOS)和基因编辑载体p YL-CmNAC56。(3)通过农杆菌介导的瞬时表达技术,将含有过表达载体p PZP221(35S-CmNAC56-NOS)的农杆菌菌液使用注射器注入成熟早期的甜瓜果实中,进行瞬时表达。通过观察分析,未注射菌液的部位正常发育,注射部位外果皮颜色推迟变黄。表明CmNAC56基因过量的表达可能对果实成熟起到一定延缓作用。(4)运用子房注射法,将过表达载体p PZP221(35S-CmNAC56-NOS)和基因编辑载体p YL-CmNAC56导入甜瓜中,通过PCR检测T_1代转化种子的阳性率分别为10.8%和9.2%,对阳性率高的T_1代种子播种在大田。T_2代果实成熟度表明,CmNAC56基因编辑的转化植株果实与野生型相比早熟2-3天,而CmNAC56基因过表达的转化植株果实与野生型相比晚熟2-3天。(5)在转化后的阳性果实中进行实验,对30 d、35 d、40 d的T_2代果实内源乙烯含量测定分析得出:三种材料中35 d时过表达果实乙烯含量较高、基因编辑和未转化果实的乙烯含量无明显差异。在T_3代种子中随机选取颗粒饱满的进行“三重反应”实验,结果显示“三重反应”效果基因编辑幼苗对照组幼苗基因过表达幼苗。对不同时期的编辑果实进行靶位点和Cas9编辑载体的q RT-PCR,结果显示:靶位点1、2均有表达,Cas9基因表达。四个发育时期的果肉q RT-PCR结果显示:乙烯应答转录因子ERF24、ERF61在基因编辑果实中的相对表达量较高,乙烯合成相关基因ACO1、ACO4在过表达果实中相对表达量较高;CmNAC56基因在编辑的果实中相对表达量较高,在过表达中相对表达量较低。对分别含有不同浓度的Cu~(2+)、Fe~(2+)、Mn~(2+)处理的幼苗根部进行q RT-PCR,结果显示:在离子浓度50 m M时具体较明显的促进作用,其中Fe~(2+)的影响作用最大,Cu~(2+)、Mn~(2+)无明显规律。综上所述,CmNAC56基因在甜瓜果实发育过程中具有一定作用,能在甜瓜发育过程中促进侧根生长,该基因至少是部分乙烯依赖型表达或可能是乙烯下游的调控因子。


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